刘 畅 王学军 支 勇 吕 艳 曹式丽

天津中医药大学第一附属医院 天津 300193

膜性肾病（MN）是临床肾病综合征中常见病理类型，以肾小球基底膜的增厚为典型病理表现。基质金属蛋白酶（MMP）是具有降解细胞外基质作用的酶类，其中MMP-9主要降解Ⅳ型胶原蛋白，而肾小球基底膜中的主要成分是Ⅳ型胶原蛋白。本实验应用MMP-9基因敲除小鼠，建立阳离子化牛血清白蛋白诱导膜性肾病模型，观察辛通畅络中药复方肾络宁的疗效，并探讨其作用机理。

1 实验材料

1.1 实验动物：远交系健康雄性Balb/c小鼠（8周龄），SPF级，由军事医学科学院实验动物中心提供(许可证号：SCXK京2016-0002)，其中MMP-9基因敲除小鼠由上海吉凯基因公司制备。

1.2 实验试剂：阳离子化牛血清白蛋白（Chondrex公司）；弗氏不完全佐剂（Sigma公司）；MMP-9（武汉博士德生物工程有限公司）；尿蛋白试剂盒（Bio-Rad公司）；总蛋白、白蛋白试剂盒（德赛诊断系统上海有限公司）；胆固醇、甘油三酯试剂盒（上海复星长征有限公司）。

1.3 实验药物：肾络宁：由柴胡、黄芩、黄芪、当归、女贞子、泽兰、水蛭、细辛组成，方药经煎煮浓缩成100ml汁液(含生药1.05g/ml)。药物购自天津中医药大学第一附属医院，由天津中医药大学药厂加工完成。

2 实验方法

2.1 动物分组：实验小鼠共40只（其中MMP-9基因敲除10只）适应性饲养1周后，非基因敲除小鼠按体重分层随机分为肾络宁组、模型组、正常组各10只。肾络宁组、模型组、基因敲除组均制备膜性肾病模型。

2.2 模型复制：采用阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）制备heymann膜性肾病小鼠模型[1]。预免疫：C-BSA 1mg，加入0.5ml PBS中，再同等量的弗氏不完全佐剂混匀配制成悬浊液，在小鼠双侧腋下、腹股沟作多点皮下注射。正式免疫：预免疫1周后，每只小鼠尾静脉注射CBSA 2.5mg(溶于lml PBS中)，每周2次，共2周。

2.3 给药方法：肾络宁组，自造模第1天起灌服肾络宁(13.65g/kg)；基因敲除组、模型组、对照组以等量生理盐水灌胃。实验共进行6周。

2.4 检测指标与方法：于给药后0周、第6周末检测尿蛋白浓度；于给药第0周自小鼠眶后静脉窦取血，第6周末小鼠股动脉取血，进行血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）等指标检测。

2.5 统计学方法：应用SPSS18.0统计软件，各组实验数据均以平均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析进行统计学分析。

3 结果

3.1 一般状况：正常组动物活动、饮食、生长均正常，造模组动物自实验开始逐渐出现进食减少，消瘦，以模型组表现明显，基因敲除组和肾络宁组则相对较轻。

3.2 尿蛋白的变化：实验前各组小鼠尿蛋白比较，无统计学差异（P＞0.05），第6周末模型组、肾络宁组与基因敲除组尿蛋白均有不同程度明显增加，肾络宁组、基因敲除组尿蛋白明显低于模型组（P＜0.05），而肾络宁组、基因敲除组间无统计学差异。见表1。

表1 实验前后各组小鼠尿蛋白的变化（±s，mg/L）

表1 实验前后各组小鼠尿蛋白的变化（±s，mg/L）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。

6周569.77±117.30 1288.55±149.25**916.51±82.18*#824.74±94.62*#组别正常组模型组基因敲除组肾络宁组例数10 10 10 10 0周371.87±48.84 359.08±16.60 327.44±27.08 366.24±81.00

3.3 生化指标的变化：实验前各组小鼠血清蛋白、血脂等指标无统计学差异（P＞0.05）。实验6周末，模型组、肾络宁组、基因敲除组TP、ALB较正常组降低，而肾络宁组、基因敲除组TP、ALB高于模型组（P＜0.05）；实验6周末，模型组、肾络宁组、基因敲除组TC、TG较正常组升高，其中基因敲除组TC低于模型组及肾络宁组（P＜0.05），基因敲除组TG高于模型组与肾络宁组（P＜0.05），模型组与肾络宁组TG无统计学差异。见表2。

表2 实验前后各组小鼠生化指标的变化（±s）

表2 实验前后各组小鼠生化指标的变化（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05；与基因敲除组比较，&P＜0.05。

组别 例数 时间(周)正常组10模型组10基因敲除组10肾络宁组10 0 6 0 6 0 6 0 6 TP(g/L)38.74±5.48 36.26±5.89 37.48±2.90 20.68±2.48**37.49±2.96 27.86±4.28*#38.50±1.34 28.95±3.51*#ALB(g/L)29.10±2.41 28.46±3.68 31.30±1.75 17.39±1.86**29.40±1.05 22.00±2.22*#31.94±1.74 22.84±1.37*#TC(mmol/L)3.73±0.67 3.92±0.68 3.48±0.65 5.24±0.25*3.00±0.95 4.32±0.37*3.75±0.45 5.02±0.53*TG(mmol/L)1.59±0.75 1.88±0.43 1.33±0.24 2.52±0.40*1.18±0.33 3.58±0.68**#1.40±0.23 2.72±0.66*&

3.4 血清MMP-9的表达：实验前正常组、模型组及肾络宁组小鼠MMP-9表达无统计学差异（P＞0.05），而基因敲除组MMP-9表达明显降低（P＜0.01）；第6周末基因敲除组MMP-9表达无明显变化，模型组、肾络宁组MMP-9表达均有不同程度增加，明显高于基因敲除组（P＜0.01），而肾络宁组低于模型组（P＜0.05）。见表3。

表3 实验前后各组小鼠MMP-9的变化（±s，ng/ml）

表3 实验前后各组小鼠MMP-9的变化（±s，ng/ml）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与肾络宁组比较，&&P＜0.01。

6周3.02±0.95 4.98±0.91 3.88±0.04#0.86±0.13**##&&组别正常组模型组肾络宁组基因敲除组例数10 10 10 10 0周3.16±0.71 2.89±0.69 2.67±0.56 0.84±0.05**##&&

4 讨论

MN病理主要是肾小球基底膜（GBM）增厚，肾小球滤过膜屏障的完整性受到破坏，从而出现大量尿蛋白。我们依据中医少阳主枢和肾络气血运行理论，结合MN证候表现，认为三焦枢机不利是病理基础，肾络郁滞为病机关键，并在长期临床基础上制定了以“疏利少阳、辛通畅络”为法的肾络宁中药制剂，方中柴胡、黄芩疏利少阳，枢转气机；黄芪、当归、女贞子补益脾肾，扶正理虚；泽兰、细辛、水蛭辛通畅络，化瘀消滞。诸药协同，疏导调节，养脏和络，促进肾络气血调畅。MMP-9是胶原酶，主要降解基膜胶原(Ⅳ型胶原)，而Ⅳ型胶原是构成GBM最基本的骨架，MMP-9是导致基底膜Ⅳ型胶原的结构和功能发生改变，出现肾小球滤过屏障功能障碍，产生尿蛋白的重要病理因素[2]，如MMP-9参与了Heymann肾炎GBM中Ⅳ型胶原的降解，导致GBM的破坏，且MMP-9的活性与GBM损伤程度相平行[3]，临床研究[4]亦证实原发性膜性肾病患者肾组织MMP-9的表达明显增强，提示MMP-9活性增加导致GBM中Ⅳ型胶原过度降解，促进GBM结构破坏。因此目前认为MMP-9表达增加是引起MN肾小球基底膜胶原降解、通透性增加，导致蛋白尿产生的重要致病因素[5]。在MN病理过程中，尿蛋白不仅是病变的重要标志，而且作为一个病理因素参与MN病变过程，对肾小球GBM有进行性损伤作用，因此减少尿蛋白排泄，改善肾小球GBM病变具有重要意义。本实验结果提示肾络宁能有效减少MN小鼠尿蛋白排泄，提高血清TP、ALB蛋白水平。同时MN中代偿性高脂血症可加重肾小球滤过膜的损害，促进尿蛋白增加。肾络宁组CHO、TG明显降低，表明肾络宁具有调节脂质代谢作用。结果显示模型组MMP-9表达升高，而肾络宁组和MMP-9基因敲除组MMP-9表达降低，因此肾络宁减少MN小鼠尿蛋白排泄，改善脂质代谢的作用，可能与通过抑制MMP-9表达，减轻肾小球GBM结构和功能的损害相关。