罗 诚，陈 莉，朱跃芳

尼美舒利是一种非甾体抗炎药，能选择性地抑制环氧化酶COX2，在发挥解热镇痛消炎作用的同时，减少了消化性溃疡等非甾体抗炎药物常见的不良反应。临床上常用于慢性关节炎、术后或急性创伤后疼痛、急性上呼吸道感染等疾病的治疗［1，2］。 尼美舒利分子中含磺酰胺结构，具有弱酸性，《中国药典》2015年版二部采用电位滴定法，以氢氧化钠滴定液测定尼美舒利原料药的含量［3］。其他文献中，尼美舒利制剂的含量测定以及血药浓度监测常采用高效液相色谱法、紫外分光光度法、薄层扫描法等［4-6］，少有以高效液相色谱法测定尼美舒利原料药含量的报道。

笔者采用高效液相色谱法测定尼美舒利原料药的含量，并与《中国药典》2015年版二部中的电位滴定法进行比较，现报告如下。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Agilent TC-C18色谱柱（250.0mm×4.6mm，5μm）、Inertsil ODS-3 色谱柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）、资生堂 CAPCELL PAK C18色谱柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XTerra C18色谱柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；916 Ti-Touch 自动电位滴定仪（瑞士万通公司）；888 Titrino自动电位滴定仪（瑞士万通公司）；ZDJ-3D全自动电位滴定仪 （北京先驱星科技发展有限公司）；848 Titrino plus自动电位滴定仪（瑞士万通公司）；AG-135电子分析天平（梅特勒-托利多）。

尼美舒利对照品 （批号100555-201202，含量100.0%，中国食品药品检定研究院）；尼美舒利原料药（批号 141182、141183，以下分别用 1#、2# 代替，天津药物研究院药业）；丙酮（批号200808、201012，分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司）、丙酮（批号201205、201307，色谱纯，天津市化学试剂研究所），磷酸、氨水均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱法

2.1.1 色谱条件 采用Agilent TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相为 0.1%磷酸溶液（用氨水调 pH 至 7.0）-乙腈 （60∶40）； 流速 1.0 ml/min，检测波长 393 nm，进样量 10 μl。

2.1.2 溶液的配制 对照品溶液的配制：精密称取经105℃干燥2 h的尼美舒利对照品约20 mg，置100 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，得对照品储备液，精密量取对照品储备液10 ml置20 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得到浓度约为100 μg/ml的对照品溶液。同法制备供试品溶液。

2.1.3 专属性试验 取2.1.2项下制备的对照品溶液和供试品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图和光谱图。图1～4表明，供试品和对照品在该色谱条件下出峰时间吻合，峰型良好，光谱图一致，说明该方法专属性良好。

图1 对照品色谱图

图2 供试品色谱图

图3 对照品光谱图

2.1.4 线性范围考察 精密量取2.1.2项下的对照品储备溶液适量，用流动相稀释成浓度为10、40、80、120、160、200 μg/ml的梯度对照品溶液。 精密量取各梯度对照品溶液10 μl，注入液相色谱仪，以尼美舒利浓度为横坐标（X），色谱峰面积为纵坐标（Y）进行回归分析，得到回归方程为：Y=21.109X-1.583，r=1.000，说明尼美舒利在 10.00～200 μg/ml的浓度范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 取同一供试品溶液（批号1#），按2.1.1项下的方法连续进样6次，记录色谱图，色谱峰面积RSD（n=6）为0.2%，说明仪器精密度良好。

图4 供试品光谱图

2.1.6 重复性试验 取同一批尼美舒利原料药（批号1#），按2.1.2项下的方法制备供试品溶液共6份，进行平行测定，结果6次测定的平均含量为99.73%，RSD（n=6）为 0.2%，说明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，在室温下放置 0、2、4、6、12、24 h 后进样， 记录色谱峰面积，RSD（n=6）为 0.4%，说明供试品溶液在 24 h内稳定。

2.1.8 加样回收率试验 将供试品（批号1#，含量99.73%）称样量减半，共称取9份，分成3组，每组分别加入相当于供试品80%、100%、120%的尼美舒利对照品，配制成供试品溶液。按2.1.1的条件进行测定，计算加样回收率，结果9份供试品加样回收率为98.61%～100.61%，平均加样回收率为99.52%，RSD（n=9）为 0.7%。 见表 1。

表1 HPLC法加样回收率测定结果

2.1.9 方法耐用性考察 采用同一批尼美舒利原料药（批号 1#），按 2．1．2 项下的方法制备供试品溶液，分别使用Agilent TC－C18色谱柱 （250 mm×4．6 mm，5 μm）、Inertsil ODS－3 色谱柱 （250 mm×4．6 mm，5 μm）、 资生堂 CAPCELL PAK C18色谱柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）、Waters XTerra C18色谱柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）测定供试品含量，结果含量分别为 99．73%、100．12%、99．79%、99．68%，RSD 为0．2%。将上述供试品溶液，采用 Agilent TC－C18色谱柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）， 在柱温为 25 ℃、30 ℃、35℃、40℃下分别进样，计算含量，结果分别为99．80%、99．92%、100．06%、99．71%，RSD 为 0．2%。改变流动相 pH 值为 6．8、7．0、7．2 测定供试品含量，每个pH值下各平行测定两次，结果主峰拖尾因子均＜2， 含量分别为 99．87%、99．75%、99．89%、100．00%、100．03%、99．51%，RSD 为 0．2%。 改变流动相比例为（55∶45）、（60∶40）、（65∶35）测定供试品含量，每个条件下各平行测定两次，结果主峰与各杂质峰达到基线分离，拖尾因子均＜2，含量分别为 99．96%、99．77%、99．90%、100．15%、99．74%、100．04%，RSD 为 0．2%。说明该方法耐用性良好。

2.2 电位滴定法

2.2.1 电位滴定参数 样品滴定参数：采用DET动态滴定模式，等当点判据标准30 mV，信号漂移20 mV/min，等当点后体积 1．0 ml。空白滴定参数：采用MET等量滴定模式，等当点判据标准5 mV，滴定液增量 0．005 ml/min，信号漂移 10 mV/min，等当点后体积 0．5 ml。

2.2.2 测定方法［3］精密称取尼美舒利原料药约0．25 g，加中性丙酮（对酚酞指示液显中性）40 ml使其溶解，加水20 ml，照电位滴定法（《中国药典》2015年版四部通则 0701），用氢氧化钠滴定液（0．1 mol/L）滴定，并将结果用空白试验校正。每1 ml氢氧化钠滴定液（0．1 mol/L）相当于 30．83 mg 的 C13H12N2O5S。

2.2.3 重复性试验 取同一批尼美舒利原料药（批号 1#），精密称取 6 份，按 2．2．2 的方法在 916 Ti－Touch自动电位滴定仪上测定，得到平均含量为100．04%，RSD（n=6）为 0．5%。

2.2.4 加样回收率试验 取已知含量的同一批尼美舒利原料药（批号 1#，含量 100．04%），按 2．2．2 项下的方法称取供试品6份，供试品取样量减半，加入相当于供试品100%的对照品后，在916 Ti－Touch自动电位滴定仪上测定，计算回收率，结果见表2。

表2 电位滴定法加样回收率测定结果

2.2.5 中性丙酮的考察 在调制中性丙酮（对酚酞指示液显中性）时发现，酚酞在丙酮中显色不明显，终点难以判断。若滴加的氢氧化钠滴定液过量，多余的氢氧化钠会与尼美舒利反应造成结果偏低。该次实验考察了中性丙酮（显微红）、中性丙酮（稍显微红）及不调中性丙酮对结果的影响，结果见表3。可以看出，当电位滴定参数设置合理时，由于空白已扣除，丙酮是否调中性对结果几乎无影响，但调过头会导致结果偏低。由于空白滴定突跃不明显，应适当将“等当点后体积”适当设大，以防出现伪终点。

表3 中性丙酮考察结果

2.2.6 方法耐用性考察 采用同一批尼美舒利原料药（批号 1#），按 2．2．2 项下的方法制备供试品溶液，分别使用916 Ti－Touch自动电位滴定仪（瑞士万通公司）、888 Titrino自动电位滴定仪（瑞士万通公司）、848 Titrino plus自动电位滴定仪（瑞士万通公司）、ZDJ-3D全自动电位滴定仪 （北京先驱星科技发展有限公司）测定供试品含量，结果含量分别为100.04%、100.53%、99.68%、99.62%，RSD为0.5%；分别使用两厂家共四批次的丙酮 （分析纯和色谱纯各两批）作为溶剂，按2.2.2项下的方法测定，结果分别为 100.26%、99.57%、99.83%、100.37%，RSD为0.4%；分别使用4份不同人员调制的中性丙酮作为溶剂，按2.2.2项下的方法测定，结果分别为100.07%、99.43%、99.78%、100.28%，RSD 为 0.4%。

2.3 两种方法测定结果比较［7］取两批尼美舒利原料药（批号1#，2#），用高效液相色谱法和电位滴定法分别测定含量，结果如表4所示。将两组结果进行F检验，得到在95%置信水平上两批样品F值均小于F临界值，说明两种方法在精密度上无明显差异。进而用t检验分析，结果两批样品t值分别为2.141 和 1.460，均小于临界值 （t0.05/2，5=2.571），表明两种方法测得的尼美舒利含量无统计学差异 （P>0.05）。

表4 两种方法测定结果比较

3 讨论

3.1 高效液相色谱法 虽然中国、英国等多国药典常采用滴定法测原料药的含量，ICH（international councilpor harmonization，人用药品注册技术要求国际协调会）也认可容量法［8，9］，但与容量法相比，HPLC法具有专属性强、灵敏度高、准确性好、取样量少和方便大批量分析等优点。特别是当原料药中存在杂质或储存期降解产生杂质，对滴定造成潜在干扰时，HPLC法更显示出独特的优势。通过对两批尼美舒利原料进行测定，发现HPLC法和电位滴定法测定结果无统计学差异，但HPLC法专属性更强、重复性及耐用性更佳。

3.2 电位滴定法 电位滴定法是容量法中的一种，具有操作简便、分析时间短、准确度高等优点［10］。2017年中国食品药品检定研究院发起了《尼美舒利含量测定能力验证》，检验方法是电位滴定法，参与此次能力验证的实验室为141家，取得满意结果的为 109家［11］，通过率 77.30%，低于同年其他项目通过率的平均值，提示该方法可能耐用性较差。该文研究发现，用电位滴定法测定尼美舒利含量时应注意两点：一是滴定参数的设置。空白滴定应设置成MET等量滴定模式，将滴定液增量设置成最小，以防过量，同时应适当调高等当点后体积，以防止得到的是伪终点。二是中性丙酮的配制。方法中使用到中性丙酮 （对酚酞指示液显中性），该次研究发现，当滴定参数设置合理时，丙酮是否调中性对测定结果没有影响，但由于调中性时丙酮变色不明显，容易调过头导致结果偏低。

两种方法均可用于尼美舒利原料药的质量控制，各有优势，采用电位滴定法时应注意参数的设置以及中性丙酮的配制。