田嘉珉 徐将 卢瑶瑶 梁景岩

225000扬州大学医学院，江苏扬州

得益于中国经济的不断发展，人们的生活质量不断提高，但同时心脑血管疾病、恶性肿瘤、糖尿病等慢性疾病对人们生命健康造成了日趋严重的威胁，在老龄化的社会结构下，心脑血管疾病的发病率更不容忽视。动脉粥样硬化是一种复杂的炎症性血管病变，导致了心血管疾病的发生发展[1]。它的发病机制主要有内皮细胞功能受损、脂质在内膜沉积、平滑肌细胞异常增殖等多种要素共同构成。动脉粥样硬化的临床表现根据受影响动脉的不同而显示出一定的特异性，如主动脉粥样硬化可以引发主动脉瘤；冠状动脉硬化可导致冠状动脉粥样硬化性心脏病；脑动脉粥样硬化易造成脑栓塞、血管性痴呆；肾动脉粥样硬化的患者有一定的概率会出现顽固性高血压；下肢动脉受累引起的皮肤温度下降、感觉麻痹和间歇性跛行亦属常见。动脉粥样硬化有血脂异常、高血压、抽烟、糖尿病和糖耐量异常等多种危险因素，其中最为主要的病因是脂质代谢失衡。当内皮细胞功能处于异常状态时，该处的血管壁不再是血浆与外界之间的阻隔，大分子物质如低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等可以自由穿过内皮细胞之间的缝隙，在管壁的最内层聚集，其氧化后产生的ox-LDL-C对于内皮细胞而言也是一种损伤因子；泡沫细胞在脂质条纹中清晰可见，是单核细胞等吞噬ox-LDL-C后形成的一种特殊形态；生理情况下位于中膜的平滑肌细胞受各种生长因子的影响迁徙至内膜，由收缩型向增殖型转化，肌纤维数量减少，大量分泌细胞外基质；进入内膜的T 细胞等分泌各种促炎介质，包括肿瘤坏死因子、白介素、干扰素等，促进血管炎症的产生[2]。纤维粥样斑块在以上多种机制的共同作用下逐渐形成。对于粥样硬化斑块是如何形成的，学术界一直众说纷纭，无论是脂质浸润学说，还是内皮损伤后产生应激，抑或是血小板聚集和血栓形成假说、平滑肌细胞克隆学说等，阐述的角度各异，但是对于不同机制之间是怎样相互作用和调节的，我们尚不明确，最近十几年中出现在我们关注范围内的微小核糖核酸(micRNA)为进一步探索动脉粥样硬化的发病机制开创了新的角度。多项研究表明，miRNA 在转录后水平调控基因表达，从而在血脂代谢、肿瘤细胞分化、血细胞生成调节等方面发挥重要调控作用[3-5]。miRNA 是一类内源性的，高度保守的非编码单链RNA，普遍存在于动、植物体内，长度为17～24 个核苷酸长度[6]。其通过结合于靶mRNA 的3'UTR，导致mRNA被直接抑制或者翻译过程受阻。miRNA 作为调节控制体内各种生理过程的“主力军”，能够影响血脂代谢、血管内皮功能等多个环节，在动脉粥样硬化的病理过程中起着不同的作用。

miRNA简介

miRNA 的历史最早可以追溯到1993年，由Lee RC 等人在研究线虫时发现[7]，许多研究团队在果蝇、线虫和人体中发现了数百个miRNAs。到目前为止，我们在动植物及病毒中已经发现了28 645 个miRNA分子。

在真核细胞生物中，成熟的miRNA是由多种核糖核酸酶处理pri-miRNA 后形 成的[8]，miRNAs 通过RNA 诱导沉默复合体接近mRNA 并依据Watson-Crick 碱基配对原则与靶mRNA 分子的3'UTR 相互结合并产生作用，从而起到影响体内各种细胞的分化、发育、增殖的作用，miRNAs 也能调节细胞的凋亡过程[9]。miRNA 与靶mRNA 的互补程度决定了miRNA 的作用方向，假如两者完全互补，则可诱发靶mRNA 被直接降解，即所谓的RNA 干扰，若miRNA 只与靶mRNA 的一部分形成互补关系，它只能阻断这一部分靶mRNA 上的信息向肽链的合成过程。

参与动脉粥样硬化病理过程的miRNAs

miRNAs 调节脂代谢：2003年，Xu等发现敲除或抑制miRNA-14的表达使果蝇的甘油三酯和甘油二酯含量增高[10]，相应的，如果增加其miR-14的表达，果蝇的血脂水平恢复正常，这一发现首次肯定了miRNA 在血脂代谢中的调节作用，并由此走上了研究miRNA 与血脂代谢关系的新征程。近几年间，miRNA-27、miRNA-33、miRNA-122、miRNA-126、miRNA-155 等的调节血脂作用陆续出现。miRNA-122是肝脏中所占比重最大的miRNA，在肝脏内所有miRNA 中大约占70%[11]，其调脂作用是依靠对肝脏内胆固醇的合成和极低密度脂蛋白的分泌调节完成的。Lanford 等人研究发现，低表达miRNA-122 可以降低HMG-CoA 等胆固醇合成相关酶的含量[12]，从而限制胆固醇的合成速率，另有团队证明抑制miRNA-122 表达后，血浆内总胆固醇、LDL、ApoA1 及ApoB 的水平均下降[13]。细胞内的胆固醇被ApoA1 和ATP 结合盒转运体A1(ABCA1)吸引并再次合成为成熟的HDL 颗粒，从外周转运回肝脏，在肝脏内完成向胆汁酸的转化或直接随胆汁排泌，称之为胆固醇的逆向转运，也被认为是人体中降低血脂水平的重要环节。miRNA-33a、miRNA-33b、miRNA-19b、miRNA-144-3p 下 调 组 织内ABCA1 的活性和表达水平，抑制胆固醇的流出和高密度脂蛋白(HDL)的形成，削弱血浆内HDL转运胆固醇的能力，并增加低密度脂蛋白(LDL)的含量[14]。miRNAs通过调节脂肪细胞内信号蛋白和转录因子等，影响脂肪细胞的分化[15]。Ling等人在研究中发现[16]，小鼠胚胎中分离出的3T3-L1前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的过程中，miRNA-375 高表达，使细胞内信号转导通路的信使蛋白表达增多，促进脂质积聚，高水平的miRNA-375 也可以磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK)，有利于脂肪细胞的分化。过表达miRNA-363 通过阻滞转录因子E2F，使细胞周期无法进入S 期，miRNA-363 抑制脂肪细胞分化的另外一种途径是抑制细胞内的信使蛋白[17]。3T3-L1 前脂肪细胞的成脂分化过程中，用miRNA 芯片分析可以显示出表达下调最为明显的是miRNA-24，脂肪相关性miRNA 转染前脂肪细胞后发现，miRNA-24 可以通过直接抑制AFABP 蛋白来抑制脂肪细胞的分化和成熟[18]。

miRNAs调节血管内皮细胞功能：尽管存在对动脉粥样硬化机制的诸多探讨，但内皮损伤和内皮细胞功能紊乱长期以来被公认为是动脉粥样硬化发生的先决条件。内皮细胞是一种扁平的鳞状上皮细胞，单层覆盖于血管内侧，阻碍血管外大分子物质进入血液，同时具备一定的内分泌功能。当血管内皮的完整性遭到破坏时，一些大分子物质如LDL就可以透过内皮进入血管，启动动脉粥样硬化的病理改变；内皮细胞可以分泌许多血管活性因子，如NO、内皮素等，生理情况下，血管活性因子之间维持平衡，能有效地调节血管张力、防止血栓的构成。Zhang 等将高表达miRNA-24 的质粒引入人脐静脉内皮细胞中，发现内皮细胞增殖明显下降，胞内内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和特异性蛋白1(Sp1)的含量均显著减少，由此推断内皮细胞增殖和eNOS合成受miRNA-24抑制，NO的合成和释放减少，血管舒张功能被破坏[19]。此外 ，miRNA-155、miRNA-222/221、miRNA-24 等miRNAs 过表达也会抑制eNOS 的表达[20-22]。动脉粥样硬化是一种在多种炎症介质相互影响下形成的病变。Chen 等在ox-LDL 刺激的单核/巨噬细胞中找到了变化最为明显的miRNA-125a-5p[23]，并通过使用相应抑制剂证实miRNA-125a-5p可以降低单核/巨噬细胞对脂质的吞噬，另一方面还能显著增加TGF-β、IL-2等细胞炎性因子的分泌。该项目组的研究还证实miRNA-125a-5p的靶基因就是ORP9，抗miRNA-125a-5p 转染的细胞中ORP9 蛋白显著高于正常细胞，表明miRNA-125a-5p 抑制了ORP9 蛋白的表达。张红娜用oxLDL 刺激人脐静脉内皮细胞测得细胞内miRNA-142-3p 含量显著高于正常细胞[24]，且呈现出一定的时间依赖性，而在相同时间间隔内测定的正常细胞中miRNA-142-3p 含量没有显著性差异。韩沛然的研究表明miRNA-365 过表达对内皮细胞的凋亡起到了促进作用[25]。高脂血症患者的miRNA-365 的表达水平明显高于正常个体，且与血脂水平有一定关系；在一个周期的调脂药物规范化治疗后，患者的血浆胆固醇减少，miRNA-365 表达水平也出现了明显下降，两者的减少程度呈现出一定的正相关性。这一结果可能表明，当人体无法将血脂保持在正常范畴内，LDL在血管壁内膜下聚积时，ox-LDL加重了内皮细胞的损害，miRNA-365 通过诸如凋亡小体一类的转运体从内皮细胞中释放到血浆中，可以检测到的miRNA-365 表达水平因此升高。黎健的研究表明miRNA-34a 通过SIRT1-FoxO1信号通路介导内皮细胞衰老和新生血管形成[26]。在已知老年小鼠心肌和脾脏中miRNA-34a 表达较年轻小鼠有明显增高的基础上，他的实验证明高表达miRNA-34a 的内皮祖细胞的衰老细胞比例增加，血管新生能力明显减弱，过表达miRNA-34a 或者阻碍SIRT1-FoxO1 信号通路都能介导内皮细胞的老化，减少新生血管形成。进一步研究表明，miRNA-34a 的表达水平对SIRT1 的影响与年龄有一定关系，过表达miRNA-34a老年小鼠内皮祖细胞中SIRT1 表达水平增加，而年轻小鼠的表现正好相反，因此，miRNA-34a 与血管内皮细胞衰老和新生血管形成之间的关系还有待进一步探查。miRNA-129-1 和miRNA-133 直接靶向血管内皮生长因子并抑制其表达，miRNA-107 则通过影响血管内皮生长因子的信号通路，间接促进新生血管的形成[27]。翁春华等人的研究表明[28]，miRNA-196、miRNA-296、miRNA-409-3p、miRNA-641可以直接结合血管生成素的3'UTR，通过抑制血管内皮的细胞增殖或管腔形成而抑制血管增生。戴运等人发现miRNA-372 靶向抑制血管生成因子AGGF1 基因并抑制新生血管[29]。

miRNAs影响血管平滑肌功能：位于血管壁中层的平滑肌细胞大多为收缩型，通过肌纤维的收缩来改变管腔的大小、调节血管的血流。在动脉粥样硬化的病程中，泡沫细胞合成并分泌血小板源生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1 等物质，平滑肌细胞受PDGF、FGF 的影响迁徙至内膜并增殖，一部分细胞分化为巨噬细胞，摄取oxLDL-C，另一部分则发生显著增殖，合成和分泌斑块纤维帽中的常见基质成分，粥样斑块的形成致使管腔直径变小，一旦纤维帽发生破溃，它可能会引起心血管常见急症的发生，如不稳定性心绞痛和心肌梗死。平滑肌细胞的异常增殖被认为是动脉粥样硬化、冠心病和再狭窄的治疗靶点之一，目前已经发现多个miRNA 参与了平滑肌细胞分型转换和凋亡过程的调控。研究发现，在球囊损伤颈动脉动物模型中，miRNA-146a 显著高表达[30]，且miRNA-146a 可能与动脉粥样硬化的发生有关[31]。在熊玮的研究中发现[32]，miRNA-146a的表达水平在血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖过程中显著增加，而加入anti-miRNA-146a 的平滑肌细胞凋亡比率上升，证明miRNA-146a 能促进平滑肌细胞的增殖，p53信号通路中的细胞周期蛋白cyclinD1 是其作用的关键点，cyclinD1的基因和蛋白表达水平上调，促进了VSMC 从G1 期向S 期的转化，使平滑肌细胞发生异常增殖，凋亡减少。PDGF在平滑肌细胞从中膜向内膜的迁移过程之中，起到了相对主要的调节作用。徐宏鑫发现[33]，Anti-miRNA-92a 能够明显抑制人主动脉平滑肌细胞在PDGF刺激下的伪足伸出数量，抑制平滑肌细胞的迁移，而miRNA-92a 可以作为哺乳动物转录因子4(KLF4)的抑制剂，使KLF4表达减少，平滑肌细胞的增殖和迁移增强。进一步研究表明，Rho 激酶通过miRNA-92a调控KLF4，促进血管平滑肌细胞的类型转换[34]。除此以外，多项研究表明过表达 miRNA-29a[35]、miRNA-31、miRNA-424/322 均可促进平滑肌细胞的增殖和迁移[36]，而miRNA-133、miRNA-365、miRNA-663等抑制这一现象[37]。

人们饮食习惯的改变和生活水平的不断提高，带来了不容忽视的问题，心脑血管疾病的患病率逐年增加，患病的初始年龄也日趋减小，从长远来看，它将对所有人的健康和社会的发展产生一定的不利影响。作为循环系统疾病中的一种常见慢性病，粥样斑块的形成甚至可以从儿童期开始，目前的治疗方法主要是早期注意危险因素，防范动脉硬化的发生，合理调整营养结构，适度开展锻炼活动，主动戒烟，限制酒精摄入量等；若是已经出现了粥样斑块，就需要积极开展药物和手术治疗，用药方案主要以调整血脂、防止血小板积聚、减少血栓形成、改善心肌预后为多见，但是还没有确切有效的方法阻断粥样硬化斑块的形成。miRNAs的出现为我们探究动脉粥样硬化的发病机制和研发靶向治疗方法提供了新的思路。越来越多的研究证明，miRNAs能调控血脂代谢、内皮细胞功能调节、血管平滑肌细胞的分化增殖、血管炎症等，涉及动脉粥样硬化的多个方面。然而，关于miRNAs还有许多未解之谜，更多与动脉粥样硬化相关的miRNAs 的作用机制是怎样的，miRNAs之间存在怎样的相互调控网络，能否通过过表达或抑制某一种或几种miRNA 阻断信号通路，抑制或减缓粥样硬化斑块的产生，这些问题都将是我们下一步的研究目标。