孙萌萌,王晓佳

(中国农业大学动物医学院,北京 海淀100193)

冠状病毒是感染多种家畜、家禽、宠物以及人类的重要病原微生物,第九次国际病毒分类委员会将冠状病毒科分为α、β 和γ 三个属。其中猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)与传染性胃肠炎病毒(TGEV)属于α-冠状病毒,其在全世界流行并导致仔猪腹泻[1]。猪呼吸道冠状病毒(PRCV)是TGEV 的3 个基因缺失的突变株,相当于TGEV 的天然弱毒疫苗,因此其流行使TGEV的发生趋于下降[2]。严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)属于β-冠状病毒,是导致2003 年“非典”罪魁祸首。传染性支气管炎病毒(IBV)是γ-冠状病毒的代表,对养禽业危害重大。2011 年病毒分类委员会新增了一个δ 属,猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)成为δ-冠状病毒的研究模型,这也是引起仔猪腹泻的一种重要病原体。2017 年9 月份,中山大学发现了一种对新生仔猪具有高致死性的新型冠状病毒,命名为猪肠道-冠状病毒(PEAV),与源于蝙蝠的肠道冠状病毒(HKU2)核苷酸同源性为95%[3]。同年9 月份,浙江大学联合温氏食品集团确证了一种新的猪肠道冠状病毒(SeACoV),与HKU2 核苷酸同源性为95%,SeACoV 不与PEDV、TGEV,以及PDCoV 产生抗体交叉反应[4],这对我国新生仔猪腹泻的防控提出新的挑战。猪肠道冠状病毒的高变异特性目前已经成为仔猪腹泻防控的难点,且日趋复杂,对养猪业的健康发展构成严重威胁。

流行病学调查表明,PEDV 目前仍是引起仔猪腹泻的最主要病原体,感染仔猪死亡率可达80%以上。本文综述了该传染病近几年来的流行状况、病毒功能蛋白的致病机理,以及新型防控技术。

1 PEDV 流行病学

20 世纪70 年代欧洲(英国和比利时)最早发生了猪流行性腹泻病(PED),随之在世界范围内广泛流行,1978 年PEDV 首次被鉴定出来[5]。随着各种防控技术的发展,之后的几十年PED 逐渐减少,呈零星暴发。然而2010 年以来,该病卷土重来,不仅冬季多发,夏季发病也成为“新常态”,加之该病毒一直在变异,经典疫苗保护率低,同时返饲的做法带来很大的疾病风险,给养殖业造成了重大损失并带来更多潜在威胁与挑战。

1.1 国外流行病学调查 2013 年4 月美国发现PEDV 变异毒株,随后蔓延全国,截至2014 年6 月,已有30 个州的实验室在7 250 个猪群中检测到阳性病例;调查显示,PEDV 出现后的一年已经造成了美国400~500 万头仔猪的死亡[6]。2014 年6 月美国农业部发布了联邦政府令,要求报告所有PEDV感染病例,以随时查阅美国该传染病的流行情况。在德国北部,2014 年出现了PED 的急性暴发,同年夏天在乌克兰也暴发了PED,仔猪死亡率接近100%[7]。在亚洲的日本,2013 年10 月九州第一次发现PEDV 感染,2 个月后农场发病率达19.5%;2013 年末开始,韩国的PED 疫情显著增加,并迅速席卷全国[8]。通过病毒基因相似性的推断,PEDV在全球可能存在循环传播[9]。

1.2 国内流行病学调查 2010 年以后,PEDV 毒株发生了强毒变异,我国暴发了严重的PEDV 与TGEV的混合感染,7 日龄内仔猪致死率高达60% ~100%[10]。GenBank 中收录的数据显示,目前9 个省直辖市均有PEDV 流行,阳性率为61.10% ~78.49%,西南、西北、华北最为严重。其中,2011-2013 年间,广西34 个县144 个猪场216 份病料的阳性率为27.78%[11],福建128 份病料的阳性率为67.97%[12],安徽37 个规模化猪场186 份病料的阳性率为59.1%[13],广东102 个养殖场236 份病料的阳性率为33.05%[14],北京地区1 201 份病料的阳性率为4.66%[15]。2014-2016 年间,东北地区88 个猪场264 份病料的阳性率为74.62%[16],山东3 035 份病料的阳性率为67.49%,第四季度高达88.57%[17]。

2 PEDV 病毒蛋白及其功能

PEDV 基因组的编码顺序为5′-NSP1-15-SORF3-E-M-N-3′,病毒基因组编码结构蛋白—纤突糖蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E),15 个非结构蛋白(Nonstructural protein,NSP),以及辅助蛋白ORF3。

2.1 结构蛋白 S 蛋白是PEDV 纤突的主要成分,可以识别宿主细胞上的受体,促进病毒与细胞膜发生融合,氨基酶APN 曾被认为是PEDV 的作用受体,但未被进一步确定。我国科学家近期发现,Occludin 蛋白有利于病毒入侵细胞,可能是协助受体[18]。目前该病毒受体尚不清楚。S 蛋白拥有良好的免疫原性和反应原性,因此是设计基因工程疫苗的主要靶位,在免疫学诊断技术中的应用也比较广泛。PEDV 的变异主要发生在S 蛋白上,因此可用来探究PEDV 各毒株之间的遗传关系、流行病学以及基因突变[19]。N 蛋白是一种磷酸化的核衣壳蛋白,病毒感染早期猪体内就能检测出N 蛋白抗体,因此被作为诊断靶标之一;N 蛋白的抗原表位还可以诱导机体产生有效的免疫应答。2013 年科学家发现,缺失核仁定位信号的N 蛋白不再定位于宿主细胞核,丧失了使宿主细胞在G2/M 期停滞的能力,并影响病毒RNA 的合成,这为阐明病毒蛋白与细胞互作关系提供了新思路[20];PEDV 的N 蛋白还可诱导内质网应激并激活NF-κB,并上调表达IL-8等炎症因子[21]。最近发现N 蛋白还可以与核仁磷酸蛋白npm1 相互作用,保护病毒免受蛋白酶的水解,因而利于病毒自身复制[22]。M 蛋白对于病毒粒子装配成熟过程很重要,被作为基因工程疫苗的候选蛋白,M 蛋白还可介导α-干扰素的产生,但前提是必须有补体的存在[23]。E 蛋白在病毒的组装和出芽过程中发挥着重要的作用,近年来发现,PEDV 的E 蛋白主要定位于内质网,TM 结构域的V4 区域对调节病毒诱导的应激与免疫反应至关重要,但是不影响细胞周期,E 蛋白可能在炎症反应与持续感染中发挥着重要的作用[24-25]。

2.2 非结构蛋白 冠状病毒非结构蛋白参与调节病毒基因组的复制以及感染过程,是重要的功能蛋白。2013 年茅翔与边葶苈将冠状病毒非结构蛋白NSPs 的相关研究进行了较全面的阐述[26-27],本文综述了近几年来,PEDV 几种NSPs 结构与功能的研究进展。NSP1 是复制酶多聚蛋白N 端的裂解产物,以一种奇特的双向调节机制来抑制宿主基因的转录和表达,可通过结合在宿主核糖体上来阻止宿主蛋白的翻译。PEDV 的NSP1 的两个α-螺旋中间有6 个β-折叠结构[28],这与SARS-CoV 相似;NSP1可通过蛋白酶依赖的途径降解CBP,阻碍干扰素调节因子IRF-3 的活性[29],还可抑制IFN-β 启动子活性[30],因此利于PEDV 逃避宿主天然免疫反应。NSP3 是一种多功能蛋白,含有锌结合域,可水解NSP1/NSP2 和NSP2/NSP3,且与病毒感染早期基因组RNA 定位到复合体有关。PEDV 的NSP3 也包括两个木瓜酶样蛋白结构域(Papain-like protease,PLP),其中PLP2 可降解干扰素通路蛋白RIG-I 与STING,因此阻碍天然免疫信号的传递[31]。NSP5编码3C 样蛋白酶(3C-like proteinase,3CLpro),是病毒成熟所必须的蛋白,也是抗病毒抑制剂研究的主要热点。NSP5 在结晶体状态下以紧密的二聚体形式存在,被认为是蛋白酶的活化形式,N 末端对其构象影响不明显,但其缺失却可导致活性完全丧失。近期研究者们发现,PEDV 3CLpro 在231 位谷氨酸残基处可切割NEMO,影响干扰素的产生[32]。NSP7 与病毒复制的调节、转运和病毒粒子的组装有关,在感染早期定位于病毒复制复合体,而在后期则定位于膜蛋白聚集位点。PEDV 的NSP7 亦可显著抑制IFN-β 启动子活性以拮抗Ⅰ型干扰素应答[33]。目前对PEDV 编码蛋白功能相关研究较少,进一步探索病毒蛋白与细胞蛋白的互作,病毒蛋白对免疫系统的影响,病毒蛋白与复制的关系等,可为疫病防控提供新思路,并为新型疫苗设计奠定基础。

2.3 ORF3 PEDV 不同毒株的ORF3 存在着各种突变,某些病毒弱毒株甚至缺失ORF3,提示该基因与病毒的毒力有关,可用作区分毒株的标志。近期研究表明,强毒株ORF3 蛋白具有离子通道活性,ORF3 基因突变或缺失可显著降低病毒滴度[34]。有一些报道表明,辅助蛋白缺失的SARS-CoV 重组病毒,其增殖能力与野生型近似,但是在动物体内感染力明显减弱,低剂量病毒即可激发T 细胞反应。作为PEDV 唯一的辅助蛋白,将流行株的ORF3 进行突变重组,可为培育高效的候选疫苗毒株提供思路。

3 防控技术

3.1 疫苗 2010 年以前,我国研究人员自行研制了灭活苗,免疫后仔猪的主动保护率达85%以上,被动免疫的仔猪保护率为90%以上[35],弱毒苗保护率为94.6%[36],TGEV-PEDV 二联弱毒苗的免疫保护率达97.7%[37]。然而,随着突变毒株的大面积流行,已有的疫苗都不能提供全面保护。当前我国研究者将PEDV 突变毒株进行了生物学鉴定,疫苗临床前试验也在紧密开展。2017 年Vaccine 期刊报道了2 篇我国研究人员关于PEDV 疫苗的研究进展。其中一个团队将Zhejiang08 毒株进行致弱,免疫后诱导仔猪产生了高滴度中和抗体,免疫14 天后的仔猪对流行毒株感染产生了完全保护[38]。另一个研究团队将灭活苗用生物可降解的纳米颗粒进行包被,鼻内接种给晚期妊娠母猪,发现新生仔猪获得良好的被动免疫,死亡率降低[39]。2013 年美国PED 暴发后,硕腾公司基于新分离的毒株研制出弱毒苗,HARRIS 公司研发了甲病毒RNA 复制子疫苗[40]。韩国与日本也相继研制出灭活苗83P-5、96P-4、KPEDV-9、SM98P 等,可诱导新生仔猪产生体液免疫来对抗PEDV 的感染[41]。近年来PEDV 基因工程疫苗的研发也获得了很多关注,如转基因植物、乳酸菌,以及酵母疫苗。研究者们在烟草中转入了PEDV 的S 基因或其主要抗原位点,给小鼠饲喂这种转基因植物可诱导小鼠产生全身免疫和黏膜免疫,对仔猪也有良好的保护作用[42-43]。研究者们还构建了PEDV 的S 基因不同片段及N 基因重组益生菌表达系统,这种靶向黏膜树突状细胞的口服疫苗能有效诱发益生菌分泌型免疫球蛋白A 以及体液免疫反应,有效提高疫苗抗原传递效率,为诱导有效的免疫应答提供有效策略[44]。此外,利用酵母表达系统作为载体,构建含有S 基因的疫苗,可诱导高水平IgA 且可有效地激发细胞免疫[45]。

3.2 抗病毒制剂 目前尚无商品化抗病毒制剂。较早时采用高免血清与卵黄抗体等方法,即将PEDV 感染产蛋母鸡,然后收集卵黄制备高效价的卵黄抗体作为治疗剂,治疗后仔猪死亡率降为16.7%[46]。有研究者制备了高免血清,治愈率达87.5%[47]。在药物开发过程中,天然产物是重要的宝库,近年来研究逐渐增多。据报道,槲皮素-7-鼠李糖苷可高效抑制PEDV 复制,IC50为14 ng/mL[48]。近期发现银杏果皮提取的多糖可抑制病毒入侵,IC50为1.7 μg/mL[49]。此外,海藻的几种多酚类提取物,可在μmol/L 浓度抑制病毒入侵与复制[50];从山茶花中提取的几种齐墩果烷三萜,可在μmol/L 浓度抑制PEDV 蛋白合成[51]。本课题组筛选出一种植物提取生物碱,在500 nmol/L 使用浓度下可完全抑制PEDV 感染细胞,0.05 mg/kg·bw 使用量可使感染仔猪的组织病变与症状完全消失[52]。此外,还有一些复方药物的报道,如对212 头发病仔猪后海穴注射穿心莲加黄连素,注射1~2 次即痊愈[53];将参苓白术散灌服患病仔猪,后海穴注射头孢曲松钠+链霉素+黄芪免疫肽,也取得了显著的治疗效果[54];将金银花、黄连等中药提取物治疗仔猪腹泻,治愈率可达94.44%[55]。这些天然产物具有抑制病毒复制、调节免疫反应、抗炎镇痛等功效,靶向宿主细胞的抑制物亦可最大限度地减少耐药性可能,而多靶位制剂的联用有望进一步安全、有效地发挥抗病毒效果。

4 展望

毋容置疑,当前PEDV 感染仍然呈现严重态势,关于PEDV 的研究存在着一些挑战:(1)该病毒的分子致病机理尚不清楚;(2)遭受PEDV 的猪场可能在地区或全国范围内成为潜在传播的病原储藏库;(3)病毒变异株的出现速度快,基于经典毒株CV777 研制的疫苗已经不能对猪群提供完全的保护;(4)当前的疫苗抗原递呈途径(口腔或者鼻内接种)并不理想。PDEV 的防治仍以疫苗为主,筛选以临床分离培养的变异毒株作为疫苗候选毒株,驯化出免疫原性好且毒价高的弱毒株,将是PEDV 常规疫苗研发和产业化的重点。此外,目前临床上将具备抗病毒活性的生物提取物作为添加剂或者联合制剂使用,成为该疫病紧急防控策略的重要组成部分,这也为疾病的防治提供了新的思路。相信随着分子生物学、免疫学、基因工程技术的不断发展,以及PEDV 致病机理和免疫机制研究的深入研究,将逐步推进PEDV 疫苗以及生物治疗制剂的研发进程,为该病毒性传染病的防控乃至净化作出重要而积极的贡献。