刘太峰,孙明洁,胡桂学

(1.吉林工程职业学院生物工程学院,吉林 四平136001;2.吉林农业大学动物科学技术学院,吉林 长春130118)

近些年养猪场备受仔猪腹泻的困扰,而猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起腹泻的最主要病原之一。PEDV 是冠状病毒科冠状病毒属成员,为有囊膜的单股正链RNA 病毒,基因组全长约28 000 nt,编码4 个结构蛋白(S、E、M 和N)和3 个非结构蛋白(ORF1a、ORF1b 和ORF3)。其中S 蛋白是PEDV 最重要的结构蛋白,主要负责结合细胞受体,调节病毒感染,在病毒侵入宿主细胞、组织嗜性和诱导中和抗体的产生等方面发挥重要作用[1]。1971 年PEDV 首次在英国被发现,随后广泛流行于世界各地。然而,PEDV 毒株的分离一直是其深入研究的瓶颈问题,直到1988 年Hoffman 首次利用胰酶及Vero 细胞成功分离到PEDV 毒株[2]。随后,陆续有研究利用Vero 细胞成功分离了CV777、DR13 和83P-5 等细胞适应性毒株。起初这些毒株的传代并不稳定,病变效应也不明显,通过高传代次才能获得稳定的生长能力。PEDV 毒株是如何适应细胞的分子机制也不明确,多数实验室均面临着PEDV 毒株传代培养不稳定的问题。因此,当前研究焦点多集中在病毒的S 蛋白、胰酶、pAPN 和细胞系等影响因素,在PEDV 分离培养中的作用。本文从以上几种因素的最新研究进展进行综述,以期为PEDV 稳定体外培养和细胞适应机制研究提供参考。

1 S 蛋白及其功能

PEDV S 蛋白是病毒表面的“花冠”即纤突,属于Ⅰ型膜融合蛋白,由4 152 nt 编码1 383 个氨基酸,由N 端的受体结构域S1 和C 端的膜融合区S2共同组成。其中,S2 区还可分为3 个亚区,为跨膜固定区、胞外区和胞质尾区。C 基末端主要由疏水氨基酸组成,可对S 蛋白起到定植作用,与病毒粒子的吸附感染和抗原性密切相关。2010 年一种不同于CV777 的变异毒株广泛流行,经过基因比对分析发现,变异株相比CV777 在S 基因共有198 个碱基发生突变,其中存在15 个碱基的插入和6 个碱基的缺失并伴有大量点突变,S1 区突变占73.3%。变异株不仅造成当前疫苗免疫的失败,而且改变了多个抗原位点,产生了多种未知的影响。因此,分离当前变异毒株,制备流行株疫苗迫在眉睫。研究显示,冠状病毒成功感染靶细胞需要完成两步,首先通过依靠宿主细胞受体与细胞表面相结合,然后病毒的囊膜与细胞膜融合并释放病毒基因组进入细胞质,而这两步的完成均需要S 蛋白的调控[3]。对最初的典型Ⅰ类细胞膜融合蛋白,禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的HA 蛋白融合特征进行分析发现,在HA 蛋白融合过程中最关键的一步即HA需要被水解成HA1 和HA2 两个片段,随后受体结合亚单位HA1 与靶细胞表面的唾液酸受体结合。HA2 通过结构转变形成α-螺旋的七肽重复序列,并逐渐变化形成紧凑的卷曲结构,而利于病毒基因组释放进入靶细胞[4]。PEDV S 蛋白同样也是位于病毒表面的Ⅰ类跨膜蛋白,其具有流感病毒HA 很多相似的结构和融合机制。因此对于PEDV 分离培养,可以参考流感病毒HA 的构象变化机制,对触发S 蛋白构象的不同因素进行分析研究,阐明PEDV S蛋白融合机制和诱导受体结合的条件,为PEDV 毒株稳定体外增殖及疫苗株开发创造可能。

2 蛋白酶

2.1 胰蛋白酶 胰酶是一种典型的丝氨酸肽酶,已广泛应用于多种病毒的体外分离研究中,主要负责裂解激活糖蛋白。当前研究显示,鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus,MHV)的S 蛋白可被胰酶裂解为S1 区和S2 区两部分,而这个裂解位点可促进病毒与细胞的融合[5]。Matsuyama 研究发现,多数冠状病毒感染过程基本相同,囊膜蛋白需要两步构象改变。首先,病毒的S1 区与特定的受体蛋白结合,随后通过蛋白水解酶或其他条件触发S蛋白发生一系列构象改变,最终形成易于细胞膜融合的六螺旋体结构(6HB)[6]。Shirato 等通过控制胰酶的有无,对感染的Vero 细胞进行病毒感染试验,结果发现,胰酶存在的条件下PEDV 感染增强并被有效的释放到培养液中,而在无胰酶存在的情况下病毒释放受到较大的阻碍,并对无胰酶条件培养3 d 的Vero 细胞经胰酶瞬时处理,通过电子显微镜发现病毒可立即从感染的细胞中释放到培养液中[7]。Wicht 等人为了明确胰酶在PEDV感染中的作用,通过使用非胰酶依赖株DR13(caPEDV) 构建的反向遗传系统研究分离株PEDV S 蛋白与胰酶的作用方式,结果显示,胰酶可作用于受体结合后的wtPEDV S 蛋白并确定了Ⅰ类融合蛋白的融合亚基N 端位置是胰酶依赖性侵入细胞区,暗示融合肽上游的保守精氨酸位点是潜在的胰酶切割位点[8]。 上述研究均表明,PEDV S 蛋白的激活需要胰酶的切割,胰酶在PEDV 感染和释放中起到关键作用。因此,胰酶是影响PEDV 毒株分离培养的主要因素已获得广泛的认可。

2.2 弗林蛋白酶 弗林蛋白酶(Furin)是一种类似于枯草蛋白酶的内切酶,多数冠状病毒在S1/S2交界处具有弗林蛋白酶的酶切位点。弗林蛋白酶属于前体转化酶家族(PC),除弗林蛋白酶外PC还有6 个可识别R/K-(X)0,2,4,6-R/K 单个或配对的氨基酸的丝氨酸蛋白酶,包括PC1、PC2、PC4、PC5、PACE4 和PC7,另外两种蛋白酶SKI-1 和PCSK9 可裂解非碱性残基位点[9]。 Li 等为了评估PEDV S 蛋白在融合激活和培养繁殖方面是否可用内源的宿主蛋白酶而不使用外源的胰蛋白酶,通过取代S 蛋白中的单个氨基酸引入了弗林蛋白酶人工切割位点,构建了一个人工弗林蛋白酶可裂解的融合肽N 端的重组PEDV S 蛋白(PEDVSFCS),结果显示,PEDV-SFCS能够独立于胰酶在培养细胞中复制,但是滴度相比胰酶存在时较低[10]。以上研究均表明弗林蛋白酶可以作为PEDV 感染繁殖的影响因素,但是其相比胰酶的作用效果还有明显的差异,但却开辟了一种PEDV 体外分离培养的新思路。

2.3 其他蛋白酶 TMPRSS2 蛋白酶是II 型跨膜丝氨酸蛋白酶或TTSPs 蛋白酶家族的一部分,虽然TMPRSS 蛋白酶的基质特异性的定义尚未明确,但通常认为其与胰蛋白酶的特异性相似。有研究显示,TMPRSS 可在呼吸道中广泛表达并与多种呼吸道病毒如MERS-CoV、SARS-CoV 和HCoV-229E 的激活密切相关[11]。TMPSS2 可切割AIV 的HA 蛋白并可使AIV 在无胰酶存在的条件下进行多周期的病毒复制[12]。同样有研究证实,通过不断表达的TMPSS2 可以裂解人偏肺病毒(Human metapneumovirus,HMPV)的融合蛋白而加强病毒的复制[13]。有学者利用TMPSS2 探索对同样是冠状病毒的PEDV 分离培养是否有影响。该研究使用蛋白酶抑制剂Leupeptin 处理感染可表达TMPSS2 的Vero 细胞后,PEDV 感染被强烈的抑制且培养液中病毒滴度也同样较低。电子显微镜观察发现,用Leupeptin 处理的PEDV 感染的Vero/TMPSS2 细胞在其表面上保留了大量的病毒粒子,而在胰酶或无抑制剂Leupeptin 存在的情况下,几乎不会形成这样的病毒簇。由此说明,TMPSS2 对PEDV 生命周期的晚期有很重要的影响,可促进PEDV 从感染的细胞中释放进入病毒液[7]。Shi 等通过对TTSPs 家族的TMPSS2、DESC1、HAT 和MSPL 蛋白酶进行评价,判断其是否可促进PEDV在Vero 细胞上的快速增殖,结果显示,TMPSS2 和MSPL 可与S 蛋白进行共定位且可被它们所裂解,促进病毒与细胞的融合。因此,TMPSS2 和MSPL这两种宿主蛋白酶为PEDV 在体外稳定生长、提高病毒滴度和扩大产量提供了一种新视野[14]。通过以上比较研究表明,TMPSS2 同样具有胰酶在PEDV 感染中的作用,其可在促进这种较难分离培养的PEDV 中扮演重要作用,为PEDV 的体外增殖提供一种新方法。 有研究显示,组织蛋白酶、弹性蛋白酶和纤溶酶等一系列蛋白酶已经应用到冠状病毒和禽流感病毒的体外分离感染中。PEDV 的分离培养也可选择性的优化使用多种酶源进行辅助研究,最终建立一套稳定的病毒分离培养方法。

3 pAPN

氨基肽酶N(Aminopeptidase N,APN)即CD13,是一种典型的Ⅱ型锌金属蛋白,广泛存在于多种器官、组织和细胞中,密切参与到抗原递呈、细胞分化、细胞运动和冠状病毒等病毒的侵染。研究显示,APN 可作为HCoV-229E、FCoV 和CCoV 等冠状病毒的感染受体,与PEDV 同属的冠状病毒猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)也以pAPN 为受体。广大学者也对pAPN 是否为PEDV 受体进行广泛研究。多数研究者发现,pAPN 在PEDV 的体外感染中发挥重要作用。通过其可促进PEDV 的感染复制,推断出其也有可能作为PEDV 的感染性受体[15-17]。但是这些研究结果仍存在诸多疑问,如PEDV 不可在含有pAPN 的ST 细胞上培养增殖,却可在不含pAPN 的Vero 细胞增殖,由此说明病毒与受体结合可能并不是病毒感染靶细胞的唯一必要途径。日本学者Shirato 对以上试验研究缺少以TGEV 作为pAPN 结合的阳性对照而提出质疑,随后通过实验证明pAPN 并不是PEDV 的受体,但可轻微促进PEDV 感染[17]。Li 等使用MDCK 细胞过表达pAPN,证明该细胞只对TGEV 敏感而对PEDV 不敏感,而且与TGEV-S1 不同,PEDV-S1不会展现出与细胞表达的或可溶的pAPN 结合的特性。通过pAPN 预处理和CRISPR/Cas9 等试验均展现出pAPN 不是PEDV 的功能性受体。因此,通过以pAPN 作为PEDV 稳定体外分离培养的功能性受体,促进病毒的稳定培养仍有待商榷[18]。PEDV 能否通过真正的功能受体促进体外稳定的培养,仍需研究去探索。 pAPN 很可能是通过与PEDV S 蛋白在构象融合时轻微促进病毒感染,但并不能成为PEDV 分离培养的关键影响因素。

4 细胞因素

PEDV 已流行近50 年,且以经典和变异两种毒株共同流行,但是其稳定分离培养的细胞系仍主要以Vero 细胞为常用的细胞。 研究显示,PEDV 可在许多种属细胞系中进行分离培养,如猪、猴、鸭子、猫、蝙蝠和人等[19-20]。通过添加胰酶可在人源的Huh-7 和MRC-5 细胞系培养PEDV 并可产生明显的细胞病变[21]。Shi 等建立了一种新颖的PEDV 分离培养方法,即利用猪肠上皮细胞(IEC)分离PEDV,最终成功分离了一株PEDV NJ 株。该细胞系产生的CPE 比Vero 细胞更快,通过传至45 代病毒滴度可达104.5TCID50/0.1 mL[22]。随着研究的不断深入,多种细胞系如PK、Hela、CPK、ESK 和MDCK 等细胞系都已广泛的应用到PEDV 的分离培养试验中。PEDV 虽然较难分离培养,但其有较大的细胞嗜性范围,因此PEDV 分离很可能不仅局限于某种条件才能促进其稳定培养,而是具有一定的共性基础科学问题需要解决。

5 展望

通过对我国养猪场疾病调查,发现PED 以71.79%高居发病率榜首,案例发病率可达75.47%。我国当前主要以PEDV 变异毒株作为主要流行毒株,以经典毒株CV777 开发的疫苗已不能有效预防该病的发生。因此,为了研制变异毒株疫苗,需要突破PEDV 稳定分离培养的瓶颈和病毒滴度低等一系列问题,寻找PEDV 稳定分离培养的关键因素迫在眉睫。 基于以上综述分析,一直以pAPN 作为PEDV 受体的研究饱受质疑而不能成为最有效的分离条件,但PEDV 有较广的细胞嗜性范围并可与胰酶等丰富的酶系统相互作用而利于病毒分离。希望在不久的将来能揭开外源和内源蛋白酶在PEDV 分离中作用的神秘面纱或寻找到真正影响PEDV 分离培养的关键因素。