杨君珑，刘小龙，李帆，曹兵，张维江

1. 宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2. 宁夏大学土木学院，宁夏 银川 750021

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，对土壤有机质的分解和腐殖质的形成具有重要作用，是土壤有机碳代谢、土壤养分循环的主要驱动力之一（Deng et al.，2016）。土壤微生物群落组成特征可表征土壤物质代谢的旺盛程度，能够客观地反映土壤肥力大小。因此，土壤微生物群落特征可作为土壤肥力的重要指标之一（杨宁等，2013）。土壤微生物对碳源的利用能力则可以表征土壤微生物自身的生长情况。Biolog-ECO微平板技术通过土壤微生物不同碳源的利用差异来评价土壤微生物群落代谢多样性和功能多样性（Rutgers et al.，2016）。目前该技术主要被应用于比较不同土壤类型、不同植物群落类型下的同类土壤（杨宁等，2016）、不同土地利用方式下的土壤（蔡进军等，2016）、植物根际和非根际土壤（安韶山等，2011）等的土壤微生物群落的代谢多样性。

宁夏回族自治区地处中国西部，是中国的生态系统脆弱区之一。其中，宁夏中南部地区生态环境尤其脆弱，过重的环境承载负荷使得当地贫困人口基数巨大（韩文文等，2016）。因此，宁夏回族自治区政府提出“生态移民”政策。针对生态移民迁出后当地的生态恢复，宁夏回族自治区政府在2013年提出《宁夏生态移民迁出区生态修复工程规划(2013—2020年)》（宁夏回族自治区人民政府，2013）和《关于加强生态移民迁出区生态修复与建设的意见》（宁夏回族自治区人民政府，2013）。若要实现自治区提出的建设目标，就需要明确植被恢复建设的模式，评价不同植被恢复方式对土壤环境的改善效果。

宁夏南部的六盘山山区是生态移民迁出的重点区域。作为黄土高原区最重要的水源涵养林地之一，六盘山生态系统的稳定对宁南山区的气候调节和生态平衡意义重大（孙浩等，2016）。近年来，许多学者对宁南山区植被恢复建设及其生态影响等方面开展了一些研究，如程曼等（2010；2013）、朱秋莲等（2013）对宁南山区不同恢复模式下土壤团聚体与有机碳、土壤理化、土壤腐殖质的相关性进行了比较分析研究，并对土壤养分效应和土壤微生物特征进行研究，表明退耕还林和植被恢复措施改善了土壤环境。有研究对不同植被恢复模式的土壤质量响应进行评估，认为在宁南山区，种植紫花苜蓿（Medicago sativa）、柠条（Caragana korshinskii）是较好的生态重建和植被恢复方式（金晶炜等，2014）。对宁南地区土壤微生物功能多样性的研究仅见安韶山等（2011）对9种植物根际非根际土壤的比较，结果发现不同植物根际与非根际土壤之间的土壤化学性质、土壤微生物活性、土壤微生物多样性指数和均匀度指数存在不同程度的差异，说明植物根系对于土壤微生物功能特征的重要作用。本研究选择位于六盘山腹地的泾源县六盘山镇海子村为研究区，于 2013年进行不同植被恢复模式的设计并施工（表1，表2），在2017年调查分析不同植被恢复模式的土壤微生物功能多样性特征，以揭示6种不同人工植被恢复模式和自然恢复模式对土壤微生物功能多样性的影响，为植被恢复保育和生态系统的可持续建设提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

宁夏六盘山海子流域处于泾河水系的颉河流域，位于宁夏泾源县北28 km处的六盘山镇，处于六盘山段东麓，为六盘山土石山林区，属于黄土丘陵沟壑区的第二副区。地理位置为东经106°14′24″，北纬35°36′31″，流域地势西北高、东南低，海拔高度为2186~2835 m，相对高差649 m。研究区多年平均气温为5 ℃，多年平均蒸发量为810 mm，多年平均降水量为602 mm。流域土壤类型为侵蚀黑垆土，土质疏松，抗蚀性差。移民迁出区，主要土地利用方式为耕地，尤其是坡耕地所占比重较大，林草土地面积较小，仅占土地总面积的15.9%。植被类型属森林草原向干旱草原过渡区，天然植被主要为低矮稀疏的草地，人工植被为稀疏的乔木及灌木，人工草地主要种植分散和小面积的紫花苜蓿。地貌类型以黄土梁峁侵蚀地貌为主，沟壑纵横，梁峁相间，地形支离破碎，水土流失严重，多年平均侵蚀模数为 3500 t·km-2·a-1（胡婉婷等，2015）。

表1 不同植被恢复模式概况Table 1 Generalinformation of different vegetation restoration models

表2 不同植被恢复模式土壤养分特征Table 2 The soil nutrient character of different vegetation restoration models

1.2 土壤样品采集和Biolog-ECO实验

2017年9月，选取7种不同植被恢复模式作为研究对象，每种模式设置3个重复样地，样地大小5 m×20 m。每个样地按照S形设置10个点，用土钻采集0~20 cm土壤样品，同一样地土壤样品充分混匀，去掉石砾、动植物残体及杂质，将土样装入自封袋内带回实验室，保存于4 ℃冰箱内用于土壤微生物功能多样性的测定。Biolog-ECO技术通过96孔微孔板中不同的碳源底物来分析评价土壤微生物生理代谢特征，在恒温培养条件下，土壤微生物群落利用不同类型的碳源后，使得平板微孔内吸光值发生不同程度的变化。因而，利用每个微孔板吸光值可以计算土壤微生物群落功能多样性指数，具体实验方法见文献（Fang et al.，2009）。

1.3 数据统计分析

土壤微生物的代谢活性用每孔平均颜色变化率（Average Well Color Development，AWCD）来描述，土壤微生物功能多样性指数采用Brillouin指数 Shannon-Weiner指数和 Pielou均匀度指数来表征。具体计算方法见参考文献（董立国等，2011）。

不同植被恢复模式的土壤微生物 AWCD和功能多样性差异比较，运用DPS 7.05软件进行双因素无重复方差分析；运用 Origin 8.5作图；作图用Canoco 4.5软件进行主成分分析（PCA）与作图。

2 结果与分析

2.1 土壤微生物群落AWCD值的动态变化

平均颜色变化率（AWCD）反映了微生物的代谢活性，是土壤微生物群落利用单一碳源能力的一个重要指标，AWCD值的高低反映土壤微生物密度的高低，可代表土壤微生物活性的高低。计算不同植被恢复模式土壤AWCD平均值，并绘制AWCD值随培养时间的动态变化曲线（图1）。

由图1可知，每隔24 h测定的AWCD值随着培养时间的延长均呈增大趋势，这表明不同植被恢复模式土壤微生物利用碳源的量随着培养时间的延长均逐渐增大，但不同植被恢复模式相对于自然恢复土壤微生物利用碳源的 AWCD值大小有显著不同。土壤微生物群落AWCD值均在24~144 h内迅速升高，之后缓慢地升高最后趋于稳定。AWCD值的快速增加表明土壤碳源被土壤微生物大量利用，土壤微生物进入指数生长期。

结合表3不同植被恢复模式AWCD的方差分析表明，刺槐+山杏+紫花苜蓿(0.94±0.44)和油松+旱柳+红豆草混交林(0.65±0.38)土壤微生物利用碳源的量显著高于自然恢复（P<0.01），而青海云杉+油松+河北杨和刺槐+油松混交模式下土壤微生物利用碳源的量显著低于自然恢复（P<0.01），即刺槐+山杏+紫花苜蓿混交林土壤微生物代谢活性最强，而刺槐+油松(0.45±0.32)和青海云杉+油松+河北杨混交林(0.26±0.18)相对于自然恢复土壤微生物代谢活性相对较弱。

图1 不同培养时间土壤微生物碳源代谢活性Fig. 1 The metabolism of carbon source by soil microbial communities with incubation time■Picea crassifolia+Pinus tabulaeformis+Populus hopeiensis; ●Robinia pseudoacacia+Pinus tabulaeformis; ▲Robinia pseudoacacia+Armeniaca sibirica+Medicago sativa; ▼Pinus tabulaeformis+Armeniaca sibirica, □Pinus tabulaeformis+Salix matsudana+Onobrychis viciaefolia; ○Salix matsudana+ Robinia pseudoacacia+Armeniaca sibirica; △Natural recovery.The following is the same as

表3 不同植被恢复模式土壤微生物群落AWCD值方差分析Table 3 The variance analysis of soil microbial communities AWCD in different vegetation restoration models

2.2 土壤微生物对碳源的利用

图2 土壤微生物群落不同碳源变化特征Fig. 2 Variation of different carbon source of soil microbial communities■Picea crassifolia+Pinus tabulaeformis+Populus hopeiensis; ●Robinia pseudoacacia +Pinus tabulaeformis; ▲Robinia pseudoacacia+Armeniaca sibirica+Medicago sativa; ▼Pinus tabulaeformis+Armeniaca sibirica; □Pinus tabulaeformis+Salix matsudana+Onobrychis viciaefolia; ○Salix matsudana+Robinia pseudoacacia+Armeniaca sibirica; △Natural recovery

根据化学基团的性质，将ECO板上的31种碳源分成6类，即羧酸类、氨基酸类、碳水化合物类、聚合物类、胺类、其他混合物类。由图 2可知，6类碳源的利用情况均随时间的延长而增强。具体而言，刺槐+山杏+紫花苜蓿模式下土壤微生物对碳水化合物类的利用最高，高于自然恢复，而刺槐+油松、旱柳+刺槐+山杏模式较低（图2A）。6种人工植被恢复模式土壤微生物对聚合物类的利用均高于自然恢复（图 2B）；其中，刺槐+山杏+紫花苜蓿混交林最高。由图2C可知，刺槐+山杏+紫花苜蓿植被恢复模式土壤微生物对氨基酸类利用最高，油松+旱柳+红豆草混交林次之，刺槐+油松混交林较低。土壤微生物对羧酸类碳源利用最高的为刺槐+山杏+紫花苜蓿混交模式（图2D）。同时，刺槐+山杏+紫花苜蓿植被恢复模式土壤微生物对胺类利用程度也是最高，其次是青海云杉+油松+河北杨混交林（图2E），自然恢复模式为最低。由图2F可知，刺槐+山杏+紫花苜蓿植被恢复模式土壤微生物对其他混合物的利用情况也高于其他植被恢复模式，自然恢复为最低。

这表明在7种植被恢复模式中刺槐+山杏+紫花苜蓿混交土壤微生物对主要碳源利用情况均较高，优于其他模式。另外，碳水化合物类是所有植被恢复模式中土壤微生物的主要碳源，其次为氨基酸类、羧酸类和聚合物类，其他混合物和胺类利用较低。

2.3 土壤微生物群落多样性指数分析

多样性指数是微生物多样性研究中的重要参数指标，Shannon指数、Brillouin指数和Pielou均匀度指数是表征群落多样性的常用指数，均能在一定程度上反映不同利用碳源类型的差异。根据不同培养时间光密度数据 C-R，计算 Shannon指数、Brillouin指数、Pielou均匀度指数（图3），结果表明，不同培养时间多样性指数差异性不同。不同植被恢复模式中3种土壤微生物多样性指数随培养时间变化趋势一致，土壤微生物群落多样性指数随培养时间延长呈上升趋势，直至趋于稳定。

结合图3和表4可知，刺槐+山杏+紫花苜蓿和油松+山杏植被恢复模式下Shannon指数、Brillouin指数和 Pielou指数均显著高于其他混交模式（P<0.05）。这表明刺槐+山杏+紫花苜蓿和油松+山杏混交模式土壤微生物群落多样性以及种群丰富度较高。除以上两个植被恢复模式外，油松+旱柳+红豆草(4.34±0.33)和旱柳+刺槐+山杏(4.38±0.30)植被恢复模式Shannon指数显著高于自然恢复模式，自然恢复模式与青海云杉+油松+河北杨、刺槐+油松模式之间没有显著性差异。而Brillouin指数的平均值方差分析表明，自然恢复与青海云杉+油松+河北杨、刺槐+油松和旱柳+刺槐+山杏混交模式之间没有显著性差异。Pielou指数平均值方差分析表明，青海云杉+油松+河北杨、刺槐+油松、油松+旱柳+红豆草、旱柳+刺槐+山杏混交模式与自然恢复之间均无显著性差异。

表4 不同植被恢复模式土壤微生物群落功能多样性指数比较Table 4 The functional diversity of soil microbial communities in different vegetation restoration models

图3 不同培养时间土壤微生物功能多样性指数Fig. 3 The functional diversity indices of soil microbial communities with incubation time■Picea crassifolia+Pinus tabulaeformis+Populus hopeiensis; ●Robinia pseudoacacia+Pinus tabulaeformis; ▲Robinia pseudoacacia +Armeniaca sibirica+Medicago sativa; ▼Pinus tabulaeformis+Armeniaca sibirica; □Pinus tabulaeformis+Salix matsudana+Onobrychis viciaefolia; ○Salix matsudana+Robinia pseudoacacia+Armeniaca sibirica; △Natural recovery

2.4 土壤微生物利用碳源的主成分分析

根据7种不同植被恢复模式下72 h不同碳源的光密度数据对土壤微生物利用的碳源进行主成分分析。如图4所示，第一主轴解释度为36.54%，第二主轴解释度为26.83%，共解释碳源光密度变化的63.37%。图4中不同植被恢复模式（圆圈）在不同碳源投影点的相对位置（箭头）代表该碳源在该植被恢复模式中的重要程度，顺着箭头的方向，表示重要程度越高，反之，表示重要程度越低。不同植被恢复模式土壤微生物利用碳源种类和数量均有显著差异。具体而言，油松+山杏、油松+旱柳+红豆草和旱柳+刺槐+山杏植被恢复模式及自然恢复可利用的碳源较多，刺槐+山杏+紫花苜蓿混交次之，青海云杉+油松+河北杨与刺槐+油松植被恢复模式可利用碳源少，该结果和不同碳源的方差分析具有一致性。

图4 土壤微生物碳源利用主成分分析Fig. 4 PCA of the carbon source utilization by soil microbial communities1. β-methyl-D-glucoside; 2. D-galactonic acid-γ-lactone; 3. L-arginine;4. Pyruvatic acid methyl ester; 5. D-xylose; 6. D-galacturonic acid; 7.L-asparagine; 8. Tween 40; 9. i-erythritol; 10. 2-hydroxybenzoic acid; 11.L-phenylalanine; 12. Tween 80; 13. D-mannitol; 14. 4-hydroxybenzoic acid;15. L-serine; 16. α-cyclodextrin; 17. N-acetyl-D-glucosamine; 18.γ-hydroxybutyric acid; 19. L-threonine; 20. Glycogen; 21. D-glucosaminic acid; 22. itaconic acid; 23. glycyl-L-glutamic acid; 24. D-cellobiose; 25.glucose-1-phosphate; 26. α-ketobutyric acid; 27. Phenyl ethylamine; 28.α-D-lactose; 29. D. L-α-glycerol phosphate; 30. D-malic acid; 31. putrescine A. Picea crassifolia+Pinus tabulaeformis+Populus hopeiensis, B. Robinia pseudoacacia+Pinus tabulaeformis, C. Robinia pseudoacacia+Armeniaca sibirica+Medicago sativa, D. Pinus tabulaeformis+Armeniaca sibirica, E.Pinus tabulaeformis+Salix matsudana+Onobrychis viciaefolia, F. Salix matsudana+Robinia pseudoacacia+Armeniaca sibirica, G. Natural recovery

3 讨论与结论

3.1 讨论

本研究表明，在一定时间范围内，土壤微生物对不同碳源的利用随时间的延长而增强，该结果与前人研究结果相同（翟辉等，2016）。在植被恢复过程中，植被覆盖度提高，地面凋落物积累增加，其凋落物分解使得土壤有机质含量不断提高；另一方面，根系生长和细根周转使得根系残体和根系分泌物增加。而根系分泌物和地面凋落物是土壤微生物代谢的重要的能量来源（An et al.，2013）。作为土壤微生物利用单一碳源能力的重要指标，平均颜色变化率（AWCD）的高低能够表征土壤微生物群落代谢活性的高低（向泽宇等，2014）。在本研究中，不同植被恢复模式以及自然恢复之间 AWCD存在显著性差异，刺槐+山杏+紫花苜蓿模式土壤微生物 AWCD值高于其他模式，可能和刺槐、紫花苜蓿等固氮植物显著增加土壤氮含量进而提高土壤微生物总量有关；而刺槐+油松和青海云杉+油松+河北杨混交模式低于自然恢复，结合样地调查发现可能是这两个模式土壤较其他模式更加紧实，其土壤容重高于其他类型，而土壤容重过高会导致土壤微生物种类和数量下降（蒲洁等，2015）。

本研究采用 Shannon指数、Brillouin指数和Pielou均匀度指数可以从不同角度反映土壤微生物群落碳源代谢的功能多样性特征。一般而言，多样性指数越高，系统结构越复杂，稳定性相对越高（Schlatter et al.，2016）。本研究中，刺槐+山杏+紫花苜蓿植被恢复模式下土壤微生物的Shannon指数、Brillouin指数和Pielou均匀度指数均高于其他植被恢复模式，表明刺槐+山杏+紫花苜蓿模式的土壤微生物功能多样性较高，这可能是由于植物群落类型影响了微生物群落的组成。有研究表明，土壤微生物功能多样性与凋落物分解速率相关。阔叶树种较针叶树种分解更快，养分进入土壤，被土壤微生物更快利用，从而促进土壤微生物功能多样性（宋蒙亚等，2014）。本研究中，刺槐+山杏+紫花苜蓿土壤微生物群落功能多样性高于其他模式，其原因可能是更多的阔叶成分导致其土壤微生物群落结构改变。因此，需要进一步验证不同植被恢复模式对土壤微生物群落组成和结构的影响是否与对土壤微生物功能多样性的影响具有一致性。

6种不同植被恢复模式以及自然恢复土壤微生物对 6种碳源的利用情况均存在显著差异，刺槐+山杏+紫花苜蓿混交模式土壤微生物对主要碳源利用较高，可能是凋落物为土壤微生物活动提供养分来源，而凋落物的差异导致了土壤微生物可利用的碳源的差异（王珍等，2017）。不同植被恢复模式土壤微生物对不同碳源的利用情况不同，碳水化合物类是6种混交林土壤微生物的主要碳源，其次为氨基酸类、羧酸类和聚合物类，其他混合物和胺类利用最小，说明不同植被恢复模式的土壤微生物对6种碳源的利用具有选择性。董立国等（2011）研究也有相似的结论，其原因可能与植物凋落物以及根系分泌物差异有关。利用主成分分析可以比较不同处理间土壤微生物碳源利用的差异。本研究表明，刺槐+油松、旱柳+刺槐+山杏、青海云杉+油松+河北杨和油松+旱柳+红豆草混交模式对碳源种类的选择与自然恢复相比，具有明显的差异。有研究表明，土壤微生物群落结构和功能的差异与不同树种的凋落量及其凋落物化学成分有关（张圣喜等，2011）。土壤微生物功能多样性的高低可影响土壤微生物有机物的转化速率（杜滢鑫等，2016）。因此，除了注重研究植被对土壤微生物功能多样性的影响外，还应关注不同植被恢复模式对土壤微生物在养分循环方面的影响。

3.2 结论

（1）7种不同植被恢复模式中，刺槐+山杏+紫花苜蓿混交模式下土壤微生物利用碳源的量最大，而青海云杉+油松+河北杨和刺槐+油松混交林相对较弱。

（2）碳水化合物类和氨基酸是7种植被恢复模式土壤微生物的主要碳源，其次为羧酸类和聚合物类，胺类和其他混合物的利用最小。

（3）从提高土壤微生物功能多样性角度，综合认为本研究区刺槐+山杏+紫花苜蓿植被恢复模式优于其他植被恢复模式。