史生鸿，李旭军，张威，姜静，段百芸，钱飚，庄志刚

作者单位： 315010宁波，宁波市第二医院（史生鸿、李旭军、张威、姜静、段百芸、钱飚）；上海市第一妇婴保健院（庄志刚）

乳腺癌作为女性常见的恶性肿瘤，呈现逐年上升和年轻化趋势，严重威胁女性的身心健康[1-2]。目前，乳腺癌的治疗已取得显著进展，然而对于恶性肿瘤患者来说最重要的致命原因为肿瘤的转移，如能提前发现肿瘤是否转移并找出判断转移的肿瘤生物学标记物对乳腺癌的防治具有十分重要的意义[3]。传统观点认为，桥粒相关蛋白（PNN）是参与细胞连接的相关基因[4]。其不仅能促使上皮细胞紧密粘连，抑制细胞从静止向运动状态转化；而且参与调节mRNA前体的选择性剪接和转运mRNA到细胞核中[5-6]。近期研究发现，PNN基因在多种肿瘤的发生发展过程中起着重要作用[7-10]。本研究探讨PNN的表达与乳腺癌转移的关系，为研究乳腺癌的转移机制提供新的参考资料，为探索乳腺癌的治疗提供新的靶点。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 标本及临床病理资料 收集2015－2017年间宁波市第二医院乳腺癌根治术后石蜡包埋组织 80例及新鲜乳腺癌、癌旁组织80对。80例石蜡标本均为女性，年龄32～71岁，平均（51.5±2.4）岁；TNM分期：Ⅰ期+Ⅱ期43例，Ⅲ期+IV期37例；淋巴结转移53例，无淋巴结转移27例；非浸润性癌11例，浸润性癌69例。80对新鲜乳腺癌、癌旁组织标本保存于－80℃冰箱内，癌旁组织分别取自标本上切缘或下切缘。所有石蜡标本都经病理检查证实，临床资料完整，并均统一重新切片，HE染色确定病理诊断及进行组织学分级。患者术前均未接受放、化疗或内分泌治疗等任何抗肿瘤治疗。

1.2 方法 冻存的80对新鲜乳腺癌及癌旁组织取出后研磨成匀浆状，各置入1.5 ml离心管中，TRIzol（美国Invitrogen，货号140501，规格100 ml）法抽提总RNA。取抽提的总RNA通过逆转录试剂盒（美国Thermo，货号00422714，规格 100rxns）进行逆转录反应，获得cDNA，－20℃保存备用。按试剂盒提供的条件进行RT-qPCR反应，根据反应结果的数据，通过公式2－△△Ct计算PNNmRNA的相对表达水平。RT-qPCR总反应体积为10l，包括：SYBRGreen PCRMasterMix（美国罗氏，货号22682700，规格5ml）5l，正向引物0.5l，反向引物0.5l，逆转录出的DNA模板4.5l，其余用dd H2O补齐。引物序列：PNN基因（由深圳华大基因设计合成）正向引物：5’-GGTCTACAAAGGGAAGC-3’，反向引物： 5’-TTTGGCACTAGCACATT-3’；内参GAPDH（由深圳华大基因设计合成）正向引物：5’-AAGCCTGCCGGTGACTAAC-3’，反向引物：5’-GCATCACCCGGAGGAGAAAT-3’。

80例女性乳腺癌石蜡标本进行PNN蛋白表达的检测，实验严格按照免疫组织化学染色S-P试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，货号SNM504，规格160张片）进行。组织切片常规脱蜡至水，阻断内源性过氧化物酶，放入EDTA抗原修复液，PBS冲洗，兔血清封闭，滴加兔抗人PNN多克隆抗体（美国Thermo，货号 PA5-63689，1∶1000），4 ℃冰箱过夜，PBS冲洗，滴加二抗（武汉博士德生物工程有限公司，货号BA1054，1∶2000），PBS冲洗，滴加DAB显色剂，复染，常规脱水、透明，封片，显微镜观察，以PBS代替一抗作为阴性对照。PNN阳性信号呈棕褐色颗粒，主要定位于细胞核。参照Hadi等[11]的免疫组织化学反应结果的判定标准，综合考虑切片中阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比和阳性细胞着色强度两项指标，半定量判断结果。

1.3 统计方法 应用SPSS18.0软件包进行分析。计数资料采用2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PNN在乳腺癌及癌旁组织中的表达 80对乳腺癌组织与癌旁组织进行RT-qPCR检测，发现PNN在乳腺癌中的表达明显高于癌旁组织（P＜0.05）。PNN在乳腺癌中的高表达率为67.5%（54/80）。见封二彩图1。

2.2 PNN表达与乳腺癌临床病理特征关系 免疫组化结果显示 PNN在乳腺癌不同临床分期中的表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）；PNN的表达水平与淋巴结转移存在相关性（P＜0.05），而与年龄、肿瘤大小、临床分级及病理分型等无关（均P＞0.05）。见表1。乳腺癌细胞中PNN的阳性表达在镜下主要出现在细胞核中，为棕褐色颗粒。Ⅲ期+IV期PNN的阳性表达率显著性高于Ⅰ+Ⅱ期，见封二彩图2。

史生鸿，李旭军，张威，等.PNN在乳腺癌组织中的表达及其与转移的关系（见正文第1566页）

图2 PNN在不同分期乳腺癌组织中的阳性表达（DAB染色，×10）

3 讨论

乳腺癌是一类生物特征各异的疾病，乳腺癌的发生、发展是由多基因、多阶段作用的结果[12]。传统的乳腺癌治疗方案普遍存在复发难治现象、晚期患者生存率低、三阴性、化疗或内分泌耐药等问题[13]。随着分子生物学的快速发展，分子指标的靶向治疗成了目前的研究热点之一。

PNN能稳定中间纤丝与细胞桥粒的结合状态，并增强上皮细胞的黏附性，减少细胞形态的变化，防止发生上皮细胞运动。在上皮细胞黏附的建立和维持中起着不可或缺的作用[14-15]。近几年研究发现，PNN与肿瘤也密切相关。继Hodgkinson等[16]2012年首次提到PNN的高表达可能与化疗耐药的乳腺癌相关后，其他国内外学者也陆续发现PNN在移行细胞癌[7]、肾细胞癌[7]、卵巢癌[8]、结直肠癌[9]和肝癌[10]等肿瘤中扮演着抑癌或癌基因的角色，并通过不同的调控机制，参与细胞的生物学功能；且PNN的表达与肿瘤患者的预后密切相关。然而PNN在乳腺癌中的研究甚少。

表1 PNN的表达与乳腺癌临床病理特征的关系 例（%）

本研究结果显示新鲜乳腺癌组织中的 PNN表达水平高于癌旁组织（P＜0.05）；80例乳腺癌石蜡标本中，PNN在乳腺癌不同临床分期中的表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）；PNN的表达水平与淋巴结转移存在相关性（P＜0.05）。这说明PNN表达与乳腺癌临床病理特征，生物学行为有密切关系，是反映乳腺癌转移的重要生物学标记物之一[17]。

癌基因的激活或抑癌基因的突变是恶性肿瘤发生和发展的分子学基础。检测PNN在乳腺癌中表达，可提高对乳腺癌恶性表型判断的准确性，有助于深入了解肿瘤发生发展机制，并可为鉴别诊断、判断预后和基因治疗提供依据。人们对PNN在肿瘤中的研究刚起步，尤其是其蛋白的表达和调控研究尚不多，机制尚在探索阶段。因此，拓展研究参与调控PNN表达的机制，将为以PNN为靶点的肿瘤靶向治疗提供实验依据。