宋 洁，张晓松，毕 蕙

(1.北京大学第一医院妇产科，北京 100034；2.保定市第一中心医院妇科，河北 保定 071000)

临床上对于子宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)2级患者的管理一直存在争议，大量的研究证据表明CIN1为HPV一过性感染所致的病理改变，约90%妇女病变可自然消退或处于静止状态，为非子宫颈浸润癌的癌前病变，CIN3为子宫颈浸润癌的癌前病变，如果不干预，每年有1%～2%的妇女进展为浸润癌，是目前子宫颈癌早诊早治的主要目标人群。而CIN2有超过60%的妇女可自然消退或处于静止状态，尤其是年轻女性，进展为浸润癌的几率低于5%[1-3]。但同时对所有的CIN2患者进行干预，尤其是年轻妇女可导致恐惧、焦虑等情绪以及妊娠时早产、胎膜早破、低出生体重儿等的风险增加[4]。如何平衡干预的利益与风险，如何将组织学CIN2中真正的高级别病变分流出来并进行针对性的治疗是子宫颈癌预防的关键所在。由于既往的HE染色病理为形态学的诊断，人为因素较多，临床需要一种更为量化的指标来辅助病理诊断，以提高病理诊断的准确性。目前研究也发现P16INK4A表达与鳞状上皮病变的级别高度相关[5]，2012年美国病理医师协会，阴道镜检查与子宫颈病理协会也建议采用P16INK4A免疫组织化学染色进一步分流HE染色病理诊断为CIN2的患者，以提高CIN2诊断的特异性。为了进一步阐明P16INK4A免疫组织化学染色在CIN2患者分流中的作用，本研究将2010年1月至2012年12月及2014年9月至2015年4月在北京大学第一医院病理科根据HE染色诊断的CIN2患者进行P16INK4A免疫组织化学染色分层，并与既往组织学诊断的CIN2患者进行比较，分析P16INK4A在降低CIN2诊断级别及预测锥切术后高级别子宫颈鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)的作用。

1资料与方法

1.1研究对象

收集北京大学第一医院妇科门诊2010年1月至2012年12月及2014年9月至2015年4月在阴道镜指引下行宫颈多点活检诊断CIN2患者共444例，年龄在20～76岁，平均年龄(40.34±9.53)岁。所有病例均因子宫颈癌筛查细胞学和(或)人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)高危型分型检测异常转诊阴道镜检查，并对阴道镜异常发现者进行阴道镜多点活检组织病理学检查，对HE染色形态学诊断为CIN2患者行子宫颈锥切术。

1.2分组情况

444例病理诊断CIN2患者按诊断的时期分为两组，将2014年9月至2015年4月诊断的107例CIN2患者设为A组，对HE染色形态学诊断CIN2的组织蜡块再次连续切片，行P16INK4A免疫组织化学染色，全部采用P16INK4A分流。根据P16INK4A染色程度的不同又分为染色阳性组、灶阳组及染色阴性组；并将CIN2 P16INK4A染色阳性者定义为HSIL，将CIN2 P16INK4A染色阴性或灶状阳性者定义为低级别子宫颈鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)。同时将2010年1月至2012年12月(该时期尚未开展P16INK4A免疫组化染色)诊断的337例患者设为B组，CIN的诊断根据HE染色的形态学结果得出。

1.3阴道镜检查指征

细胞学未见异常但HPV高危亚型16、18、31、33阳性、细胞学不能明确意义的非典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cells of undertermined significance，ASC-US)HPV高危亚型阳性、细胞学LSIL及以上，以及所有腺上皮细胞异常者转诊阴道镜检查，在阴道镜指引下在病变最异常处行多点活检，对于不满意阴道镜检查必要时行子宫颈四象限随机活检+子宫颈管黏膜搔刮术(endocervical curettage,ECC)。

1.4子宫颈锥切术方法选择

对于阴道镜指引下多点活检病理诊断CIN2患者444例全部行子宫颈环电切术(Loop electrosurgical excision procedure,LEEP)。所有病理切片均经两位病理科医生阅片，对于诊断不一致的病理片由第三位病理医生复审。

1.5 P16INK4A蛋白的检测及免疫组化阳性结果判断

采用免疫组织化学方法检测，取子宫颈组织石蜡切片，按试剂盒说明书进行操作，一抗用鼠抗人的P16INK4A单克隆抗体(克隆号E6H4，Roche)，1∶100稀释。阴性对照为磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗，阳性对照为已知阳性的胰腺切片。免疫组化阳性结果判定：P16INK4A阳性表达定位在细胞核和细胞质，细胞核或细胞质出现棕黄色为染色阳性细胞。着色按阳性细胞所占百分比并参考着色强度确定分级如下：染色阳性组，上皮弥漫全层染色；灶阳组，局灶、不连续染色阳性；阴性组，无明显染色。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行分析，各年龄组间差异以及不同组间锥切术后病理级别的差异采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 CIN2患者年龄分布

CIN2患者年龄20～76岁，平均年龄(40.34±9.53)岁。其中A组平均年龄(41.80±10.53)岁，B组平均年龄(39.88±9.15)岁，两组患者在不同年龄段所占比例比较无统计学差异(χ2=3.698，P=0.055)，见表1。

年龄(岁)A组(n=107)B组(n=337)<255(4.7)7(2.1)25～3425(23.4)103(30.6)35～4443(40.2)134(39.8)45～5421(19.6)68(20.2)55～648(7.5)23(6.8)≥655(4.7)2(0.6)平均年龄41.80±10.5339.88±9.15

2.2 CIN2患者的HPV高危亚型检测结果

444例CIN2患者中HR-HPV检测阴性者18例，占4.1%(18/444)，阳性者426例，占95.9%(426/444)。排在前五位的亚型分别为：HPV16型，占49.1%(218/444)；HPV58型，占15.3%(68/444)；HPV33型，占14.9%(66/444)；HPV18型52型，占13.9%(62/444)；HPV31型，占6.8%(30/444)(对多重型感染者，亚型阳性率重复计算)。在A组中，HR-HPV阳性者101例，占94.4%(101/107)；在B组中，HR-HPV阳性者315例，占93.5%(315/337)。

2.3 CIN2患者子宫颈锥切术后病理结果

A组中，锥切术后病理≤CIN1共34例，占31.8%(34/107)；CIN2 44例,占41.1%(44/107)；CIN3 29例,占27.1%(29/107)；浸润癌0例。

B组中，锥切术后病理≤CIN1共133例,占39.5%(133/337)；CIN2 143例,占42.4%(143/337)；CIN3 60例,占17.8%(60/337)；宫颈癌1例,占0.3%(1/337)。

2.4 A组中P16INK4A染色的表达

在107例CIN2患者中，P16INK4A阳性者85例，占79.4%(85/107),P16INK4A灶阳者16例，占15.0%(16/107),P16INK4A阴性者6例，占5.6%(6/107)。

2.5子宫颈锥切术前及术后病理一致性的比较

阴道镜下多点活检病理诊断的444例CIN2患者，锥切术后病理CIN2及以上的共277例，病理诊断阳性率为62.4%(277/444)，子宫颈活检病理诊断的CIN2预测锥切术后病理诊断为CIN2+的阳性预测值(positive predictive valve，PPV)为62.4%。A组、B组锥切术后病理诊断CIN2及以上的阳性预测值见表2。两组患者锥切术前、术后病理结果相比无统计学差异(χ2=5.739，P>0.05)。

表2 A、B组锥切术后病理诊断CIN2及以上病变的阳性预测值比较[n(%)]

Table 2 Comparison of PPV of CIN 2 and above in pathological diagnosis after LEEP between group A and group B[n(%)]

2.6 A组中不同P16INK4A的表达与锥切术前后病理一致性的比较

按P16INK4A染色程度不同进行进一步分层分析，P16INK4A阳性组与P16INK4A灶阳组及阴性组相比较，锥切术前后病理一致性的差异有统计学意义(χ2值分别为10.603、10.733，均P<0.05，调整α’=0.0167>P值)；灶阳组与P16INK4A阴性组相比较，锥切术前后病理一致性的差异无明显统计学意义(χ2=0.873，P=0.350)。

如果采用下生殖道鳞状细胞诊断术语(lower anogenital squemous terminology，LAST)的诊断标准，A组中有22例P16INK4A阴性者归为LSIL，占20.6%(22/107)；另85例P16INK4A阳性者归为HSIL，占79.4%(85/107)，则A组子宫颈活检病理诊断的HSIL预测锥切术后病理诊断为CIN2+的阳性预测值提高至77.6%。

2.7 B组与A组中不同P16INK4A结果的比较

B组与A组中P16INK4A阳性组相比较，锥切术前后病理一致性的差异有统计学意义(χ2=8.626，P=0.003)；B组与P16INK4A灶阳组相比较，锥切术前后病理一致性的差异无明显统计学意义(χ2=7.818，P=0.098)；B组与P16INK4A阴性组相比较，锥切术前后病理一致性的差异有统计学意义(χ2=18.143，P=0.001)，见表3。

表3 B组与A组中不同P16INK4A结果下锥切术后病理结果的比较[n(%)]

注：aP16INK4A阳性组与灶阳组比较；b灶阳组与阴性组比较；c阴性组与阳性组比较；dB组与A组P16INK4A阳性者的比较；eB组与 A组P16INK4A灶阳者的比较；fB组(组织学CIN2)与A组P16INK4A阴性者的比较。

3讨论

3.1 P16INK4A免疫组织化学染色可对HE病理诊断的CIN2分流，提高HSIL诊断的一致性

目前的研究发现P16INK4A蛋白可与cyclinD1竞争性结合CDK4，抑制CDK4 酶活性，P16INK4A/CDK-cyclinD/Rb分子复合物是细胞出G1期进入S期的关键因子，该分子链中任何基因异常都可使该分子失去细胞周期的控制作用。高危型HPV表达的E7蛋白通过与PRb结合扰乱了Rb基因的正常功能，使其功能失活，解除了PRb对P16INK4A蛋白表达的负反馈抑制，引起P16INK4A过表达[6]，导致宫颈上皮细胞的细胞周期发生紊乱，使其具有永生性的特点而启动一系列癌变过程[7-10]。李思琦等[11]曾对35岁以下CIN患者的病理切片行P16INK4A及Ki67免疫组化染色，发现二者染色的阳性率与CIN的分级有着非常好的一致性。

既往的研究发现不同病理学家对于HE染色诊断的CIN2的可重复性差，一致性低于50%[12]。2007年在美国癌症协会督导项目中Castle等两位病理专家回顾CIN2病理片的诊断一致性仅有13%及31%，而CIN3的诊断一致性可达84%及81%。2009年在美国ALTS研究中Dalla 等发现CIN2的可重复性仅有43%。Meta分析发现与单纯HE染色相比，辅助使用p16INK4A染色提高了诊断者间的诊断一致性[13]。2012年美国病理医师协会和阴道镜检查与子宫颈病理协会建议采用肛门下生殖道HPV相关的鳞状上皮病变术语，将既往的子宫颈上皮内瘤变病理诊断分级分类法改为二级分类，即LSIL与HSIL，并建议采用P16INK4A免疫组织化学染色对HE病理诊断的CIN2进行进一步分流，将CIN1及CIN2 P16INK4A阴性者归为LSIL,将CIN2 P16INK4A阳性及CIN3归为HSIL，2014年WHO出版的第4版《女性生殖器官肿瘤分类》关于子宫颈鳞状上皮癌前期病变也建议采用了鳞状上皮内病变两级命名即LSIL与HSIL。

3.2 P16INK4A免疫组织化学染色分流CIN2可降低20.6%患者的诊断级别，提高预测锥切术后CIN2+的能力

本研究通过对不同时期CIN2锥切术前后病理级别的对比发现阴道镜下多点活检病理诊断CIN2的对于锥切术后病理CIN2+总的阳性预测值为62.4%，但经过P16INK4A染色，仅对染色阳性的HSIL患者进行治疗时，可降低20.6%患者的诊断级别，同时也减少了对20.6% CIN2患者的有创干预，并可将子宫颈活检病理诊断的HSIL锥切术后诊断CIN2+的阳性预测值提高至77.6%。Maniar等[14]的研究也发现采用P16INK4A免疫组化染色分流子宫颈活检病理诊断的CIN2患者时，可减少1/3 HSIL的诊断，同时发现用于手术前预测病变的级别更准确，可避免不必要的有创干预。Clinton等[15]的研究也发现由于广泛使用P16INK4A免疫组化染色，子宫颈活检病理的HSIL 诊断自1.4%提高至2.3%(P<0.05)，同时P16INK4A阳性的HSIL的阳性预测值由48%增加至76%(P<0.05)。

在我们的研究中也发现A组中P16INK4A染色阳性者锥切术前后的病理一致性明显高于P16INK4A染色灶状阳性及阴性妇女，分别为77.6%、37.5%及16.7%，并均有统计学差异，这一结果也支持了美国LAST项目对于CIN患者进行P16INK4A分流并进行分层管理的理念。但在研究中也发现有15.0%(16/107)的患者P16INK4A染色上皮区域呈现灶状、不连续染色阳性，这部分患者按照美国LAST项目中的管理是与P16INK4A染色阴性者一并归为P16INK4A阴性，属于低级别病变范畴，建议临床随访观察。但在我们的研究中也看到对于P16INK4A灶状阳性及阴性的CIN2患者进行锥切后也分别诊断了6例(6/16，37.5%)及1例(1/6)的CIN2，由于纳入的病例仅为107例，标本量相对较小，目前尚未见到术后为CIN3的病理，但也应引起足够的重视。尤其是对于P16INK4A染色灶状阳性患者，这部分患者的临床结局与P16INK4A阴性者是否完全一致，在随访过程中进展为HSIL的比例是否高于P16INK4A阴性妇女仍需要扩大样本量，并进行进一步的前瞻性研究。但在目前尚无足够的循证医学证据的情况下建议密切随访，以免漏诊。

总之，对待CIN2患者的管理应个性化，尤其是在年轻有生育要求妇女中，建议行P16INK4A染色进一步分流，对于染色阳性者可行子宫颈消融或切除性治疗，对于P16INK4A灶状阳性或阴性妇女建议结合患者年龄、既往筛查历史、细胞学及HPV检测结果、阴道镜满意度等进行综合评估，避免治疗的过度与不足。