张志勇 于光屹 陶丹丹 高 岩 李 健 方世宇*

（大连大学附属新华医院骨科，辽宁 大连 116021）

关节软骨中软骨细胞较少，缺乏血供和神经营养，其修复能力有限。关节软骨一旦损伤，即使是很小的面积，关节退变就不可避免。关节软骨缺损分为软骨全层缺损和软骨部分缺损。组织工程学的发展提供了一种组织再生的技术手段。选择合适来源的种子细胞和支架材料是组织工程修复中常用的研究方法。骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合关节软骨脱细胞基质可修复全层软骨缺损，生成透明软骨样组织[1]。本研究用骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合关节软骨脱细胞基质修复兔关节软骨部分缺损。

1 材料与方法

1.1 实验动物：选取36只3～4个月龄的健康新西兰兔，各体质量约3.0 kg，购买自大连医科大学动物实验中心。

1.2 实验试剂及仪器：胰蛋白酶粉剂、DNase粉剂，RNase粉剂，胎牛血清、二氧化碳培养箱，FD-1冷冻干燥机。

1.3 BMSCs的分离与体外培养：采用密度梯度离心法分离BMSCs，并进行体外培养[2]。

1.4 脱细胞关节软骨基质的制备：通过冷冻干燥、化学去污剂等方法制备关节软骨脱细胞基质[3]。

1.5 兔关节软骨部分缺损模型制备：选取36只新西兰兔，在兔双侧股骨踝关节面用直径为5 mm的钻孔仪钻1～1.5 mm深的孔，以不出血为标准。

1.6 实验分组和修复方法：将36只关节软骨部分缺损模型的新西兰兔随机分成3组，每组各12只，每组24个膝关节样本，分别进行3种不同的处理：A组将BMSCs与关节软骨脱细胞基质复合物修复软骨缺损；

B组单纯用脱细胞软骨基质修复缺损；C组为软骨部分缺损处不做任何处理。各组在术后4、8、12周分别处死4只新西兰兔，取双侧膝关节组织，进行大体观察，并通过HE染色对比观察缺损部位的修复情况。

1.7 统计学分析：参照Wakitani 评分量表对各实验结果进行评分，并利用SPSS 13.0分析各实验组间是否存在显著性差异。数值均以平均值±标准差（±s）表示，统计学分析采用t检验，P＜0.05表示具有显著性差异。

2 结 果

2.1 实验用兔统计：在本研究中将36只新西兰兔随机分为3组，每组12只，实验过程中无意外死亡，全部计入结果分析。

2.2 体外分离及培养骨髓间充质干细胞：密度梯度离心法分离培养兔骨髓间充质干细胞，并利用流式细胞仪分析细胞表面抗原分子，发现BMSCs特异性高表达抗原CD44，而不表达层粘连蛋白和CD34。

2.3 脱细胞关节软骨基质的制备及其特性：Massion染色结果可见关节软骨脱细胞基质中存在很多的软骨陷窝且其周围存在大量的胶原纤维。

2.4 大体观察和组织学观察：术后4周，A组软骨缺损基本修复，B、C组还可见凹陷，与周围软骨界限模糊；A组修复组织呈黄色，颜色偏淡，HE染色见少量类似幼稚软骨细胞，细胞排列不规则，周围未见典型的陷窝样结构，有较少的基质。B、C组见缺损区表面的凹陷，被覆纤维组织；术后8周，B组基本完全修复，C组还见小凹陷。A组缺损处修复组织较前增多，颜色呈淡黄色，表面较4周时光滑，有一定弹性，与周围正常软骨分界未消失。A组修复组织中可见类幼稚软骨细胞数量增多，类软骨陷窝出现，分布不均匀。B、C组缺损区为纤维组织覆盖，呈波纹状走行，修复组织异染，少而不均匀；12周时C组凹陷消失。A组缺损区修复组织色泽，质地同正常关节软骨，HE染色见类软骨细胞，其形态接近正常软骨细胞，但排列非柱状，类软骨陷窝增多。B、C组缺损区基本为纤维组织覆盖，深灰白色，质软，与周围正常软骨组织分界清楚。两组修复组织多为原纤维，呈波纹状排列，未见软骨陷窝形成。

2.5 组织学评分：各时间点各组动物利用Wakitani 评分进行组织学评分，A组各时间点的评分均优于B、C组，且差异有统计学意义（P＜0.05）；B、C组各对应时间点相比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。A组在不同时间点两两比较也有统计学差异（P＜0.05），见表1。

表1 各组各时间点组织切片Wakitani评分（±s）

表1 各组各时间点组织切片Wakitani评分（±s）

组别 时间(周) 关节数(个) 细胞形态 基质染色 表面平整 软骨厚度 与周围结合 总分A组 4 8 1.2±0.3 1.3±0.4 1.2±0.2 1.0±0.1 1.2±0.1 6.0±1.0 8 8 0.8±0.1 0.6±0.3 0.5±0.2 0.6±0.0 0.5±0.2 3.1±0.8 12 8 0.2±0.3 0.2±0.4 0.3±0.3 0.3±0.3 0.3±0.3 1.3±1.6 B组 4 8 2.2±0.4 2.0±0.3 2.1±0.4 1.5±0.1 1.2±0.1 9.0±1.2 8 8 1.8±0.1 1.8±0.3 1.5±0.3 1.4±0.0 1.0±0.2 6.1±0.8 12 8 1.2±0.2 1.5±0.5 1.1±0.4 1.3±0.3 0.9±0.5 4.2±1.9 C组 4 8 3.2±0.5 2.8±0.4 2.8±0.5 2.0±0.1 2.2±0.1 13±1.0 8 8 2.8±0.1 2.6±0.3 2.5±0.3 1.8±0.0 1.8±0.2 11.8±0.8 12 8 2.2±0.3 2,2±0.5 2.3±0.5 1.6±0.3 1.5±0.5 9.8±1.9

3 讨 论

关节软骨缺损是临床常见疾病之一。软骨的修复一直是研究的热点。组织工程的发展提供了一种新的修复方法。骨髓间充质干细胞有较强的低免疫原性和较低的抗原呈递能力，可作为种子细胞广泛应用于同种异体移植。脱细胞组织基质有良好的组织相容性，细胞吸附性以及亲水性，并最大程度模拟细胞生长的外环境，可作为组织工程中的支架材料[4]。关节软骨缺损分为软骨全层缺损和软骨部分缺损。关节软骨部分缺损未穿破软骨下骨，髓腔内的血管不会影响软骨损伤区，这不同于软骨全层缺损。

本研究中应用骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合关节软骨脱细胞基质修复兔关节软骨部分缺损，结果显示可以生产软骨样组织修复缺损部位。而单独应用脱细胞软骨基质修复缺损部位生成的为纤维组织。表明骨髓间充质干细胞在体内可被诱导分化为软骨细胞。相信在不久的将来，随着关节软骨损伤修复研究日益深入，组织工程技术将为关节软骨损伤修复提供重要手段。