宛 洋

（沈阳市第十人民医院，辽宁 沈阳 110044）

结核病是世界性难治疾病之一，虽然通过预防接种的方式一定程度上能够对该疾病起到一定的预防作用，但仍然会出现许多成年人再发性结核感染病例结核分支杆菌。人群对于结核分支杆菌免疫力降低、结核分支杆菌出现抗原性变异以及耐药性等因素是无法有效控制结核病的主要原因之一。经调查研究发现，结核分支杆菌在出现细菌L型或细胞壁缺陷后，很有可能会造成结核病再发性感染。为了对抗菌药物与抗结核药物之间的作用关系以及结核分支杆菌L型有更加良好的了解，可以通过非高渗透压培养基体外最低抑菌浓度试验，对抗结核药物作用下结核分支杆菌的L型形成情况以及部分特殊性情况进行观察与研究，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 材料：本次实验研究所选用的材料主要包含结核分支杆菌菌种、培养基、抗结核药物、抗菌药物以及基因检测试剂。结核分支杆菌菌种经过20 d的培养基接种后，采取比浊法对苏通培养基内的培养物进行稀释，经过稀释后的结核分支杆菌深度为每毫升1亿个菌细胞。

1.1.2 培养基：本次实验研究所选用的功能培养基成分包含蒸馏水100 mL，甘油6 mL、枸橼酸铁铵0.005 g、MgSO4·7 H2O 0.05 g、K2HOP 40.05 g、枸橼酸盐0.2 g以及天门冬素0.4 g。

1.1.3 抗结构药物：本次实验研究所选取的抗结核药物为乙胺丁醇、异烟肼以及利福平口服剂。利用蒸馏水分别对各种药物进行稀释并将其加入培养基，培养基内每毫升药物的浓度为乙胺丁醇1、2.5、5 μg，异烟肼0.01、0.04、0.08 μg，利福平0.05、0.1、0.2 μg。

1.1.4 抗菌药物：临床治疗用链霉素、林可霉素、氧氟沙星、庆大霉素、红霉素和氯霉素注射剂以及诺氟沙星口服剂。将各种抗菌药物利用蒸馏水分别对其进行稀释处理后将其加入培养基，培养基内每毫升药物的浓度为链霉素6 μg，诺氟沙星8 μg，林可霉素2 μg，氯霉素12.5 μg，庆大霉素4 μg，红霉素2 μg，氧氟沙星2 μg。

1.1.5 基因检测试剂：本次实验研究所取胜的基因检测试剂为由华美生物工程公司所造成的PCR检测试剂盒。

1.2 方 法

1.2.1 诱导与分离：于乙胺丁醇、异烟肼、利福平培养基中加各种结核分支杆菌，将其置于37 ℃的温箱中，通过显微镜对L型的形成情况进行观察。待L型形成完毕后对其进行过滤处理，于苏通培养基中放置过滤物，将其置于37 ℃的温箱中，对L型的生长情况进行观察。经过密集生长阶段后作磷钨酸负染色、抗酸染色后镜检、革兰染色后通过透射电镜对其进行观察。同时也含有其他药物、不含抗结核药物的苏通培养基内接种结核分支杆菌，将其置于37 ℃的温箱中，通过显微镜对L型生长情况和细菌进行观察。

1.2.2 敏感性实验：将L型非高渗透压培养基传代纯培养物及结核分支杆菌细菌型菌液分别接种于抗结核药物和不同抗菌药物的苏通培养基内，通过显微镜对L型或结核分支杆菌的生长情况进行观察，对比不含药物培养基中的生长情况。通过肉眼对培养基混浊情况进行观察，对药物敏感性进行判断，通过显微镜对L型生长情况进行判断，并根据判断结果对药物敏感性进行观察。

1.2.3 对非高渗透压培养基中的结核分支杆菌L型进行分离提取，对L型进行照像、琼脂糖凝胶电泳以及DAN扩增处理。

2 结 果

于培养基内对抗结构药物进行培养，结构分支杆菌L型清晰可见。其中乙胺丁醇2.5 μg/mL和5 μg/ mL、异烟肼0.04 μg/ mL、利福平0.1 μg/mL下所生成的L型数量最多。再经过一段时间的培养后，虽未见细菌型生长，但发现L型数量明显增加。

2.1 药物敏感性分析：经过为期15日的培养，链霉素6 μg/mL、氯霉素12.5 μg/mL、乙胺丁醇1 μg/ mL、异烟肼0.01 μg/ mL、利福平0.1 μg/mL培养基中的结核分支杆菌细菌型均未见生长，但可见L型。在林可霉素2 μg/ mL、诺氟沙星8 μg/mL、氧氟沙星2 μg/mL、庆大霉素4 μg/mL、红霉素2 μg/mL培养基中均发现混浊情况，其中庆大霉素、氯霉素未见L型

2.2 L型的结核分支杆菌特异性基因：对L型的染色体DNA进行电泳以及PCR扩增处理后，可见与亲代细菌型和阳性对照一致的带型。

3 讨 论

经实验研究发现，结核分支杆菌一方面具有肽聚糖，同时其细胞壁结构十分复杂，也含有一定量的蛋白质与脂类物质。链霉素、乙胺丁醇、异烟肼、利福平是最为主要的抗结构药物，对于结核分支杆菌的蛋白质、脂肪以及核酸代谢产生一定的抑制作用。通过本次实验研究可以发现，结核分支杆菌对于链霉素、乙胺丁醇、异烟肼以及利福等药物均具有杀菌以及抑制作用，对于L型无抑制作用。也就是在L型的状态下，其细胞壁的蛋白质、脂质以及糖类物质出现敏感性降低的现象。既在抗结核药物的作用下，结核分支杆菌形成L型，一定程度上源自于抗结核药物的无效与治疗不彻底。因此，在临床治疗过程中，需要采取抗菌药物与抗结核药物联合使用的方法，能够提高患者的治疗有效性。