汪湄，陈彻，楚慧媛

甘肃中医药大学临床学院，兰州7300000

肝细胞癌是肝硬化患者最常见的死亡原因[1]，占全部肝癌的90%以上，严重地威胁着人类的健康。慢性肝炎、肝硬化等导致的肝功能受损是肝细胞癌最重要的发病因素之一。目前，手术切除仍然是肝细胞癌的首选治疗方式，但由于潜在的肝功能障碍，手术切除在临床上并未得到广泛应用[2]。随着医疗技术的进步，肝移植已被用于肝癌的治疗，但由于大部分肝癌患者的确诊时间较晚，且缺乏肝移植的供体，故仅有约15%的患者能够受益，从而限制了肝移植治疗肝癌的进展[3]，因此化疗仍然是肝癌治疗的重要方法；但是，由于肝癌细胞对传统化疗药物产生了一定的耐药性且传统化疗药物的毒副作用较大，使化疗的应用受到了一定的限制[4]，因此，许多化疗药物增敏剂被发掘且得到高效利用，药物的联合使用使化疗效果得以提高的同时大大地减少了化疗药物的用量，降低了其毒副作用，故而受到临床治疗领域的广泛推崇。目前，一些增敏剂的作用机制尚未见报道。本课题组将三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）与3'-叠氮-2'，3'-脱氧胸腺核苷（3'-azido-2'，3'-dideoxy thymidine，AZT）联合用于肝细胞癌的治疗，虽然效果显著，但是AZT通过何种机制来起到增效的作用仍然未知，对水通道蛋白9（aquaporin 9，AQP9）的研究有望为AZT增敏机制的明确提供新的思路。

1 As 2 O 3联合AZT治疗肝癌的研究进展

1.1 As 2 O 3治疗肝癌的研究进展

As2O3是中药砒霜的主要成分，为一种剧毒药物。20世纪70年代中国学者将As2O3作为一线药物用于急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）的治疗[5]，同时也有报道显示As2O3对肝癌、宫颈癌、肺癌等有显著的疗效[6-7]。另有研究表明，As2O3可抑制肝癌细胞的增殖，诱导肝癌细胞的凋亡，并抑制肝癌细胞的侵袭和转移[8-10]。然而As2O3的毒副作用却限制了其在临床上的广泛应用，除产生恶心、呕吐等应激反应外，As2O3还可引起心脏毒性、神经毒性、生殖毒性及骨髓抑制等多个器官系统病变[11-12]。因此，在不影响疗效的情况下降低As2O3的用量，寻找其减毒增效的联合用药方案，从而增强肝癌细胞对As2O3的敏感性已成为肝癌治疗的研究重点。

1.2 AZT用于肝癌治疗的研究进展

AZT为胸苷类似物，也称叠氮胸苷，是一种端粒酶抑制药，可在肿瘤细胞的端粒复制时掺入新合成的端粒DNA链而使端粒复制终止，进而起到抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用[13]。Sabokrouh等[14]研究表明，Pt-AZT通过抑制端粒酶的活性，下调Bcl-2的表达，从而抑制小鼠肝癌细胞的增殖。Wang等[15]研究发现，AZT与大黄素联合使用可协同抑制白血病KG-1a细胞的增殖。AZT还可以与放疗药物联合应用于脑胶质瘤和宫颈癌的治疗中，通过增强射线对癌细胞的杀伤力而发挥其增敏作用[16-17]。Chau等[18]将阿扎胞苷与As2O3联合起来用于白血病的治疗，实验证明AZT能够促进白血病细胞对As2O3的吸收，增强其对As2O3的敏感性。AZT与阿扎胞苷同为核苷类药物，具有相似的结构及功能。因此，本实验组推测：AZT是一种非常有潜力的抗癌药物，与As2O3联合使用可能达到肝癌治疗的目的，并有望起到增效减毒的作用，并首次提出将AZT作为增敏药物与As2O3联合应用于肝细胞癌的治疗。

基于上述设想，本实验组开展相关研究，前期实验结果表明As2O3联合AZT可协同抑制人肝癌HepG2细胞的增殖，这一作用可能与诱导肝癌细胞凋亡、上调caspase 3和BAX表达以及下调BCL-2表达有关[9]；As2O3联合AZT能够明显抑制人肝癌HepG2细胞的迁移和侵袭能力，该抑制作用可能是通过调控ERK1/2信号通路的磷酸化以及下调MMP-2和VEGF的表达来实现的[10]。上述研究成果证明，将As2O3与AZT联合应用可抑制人肝癌HepG2细胞的增殖、侵袭、转移，并促进其凋亡，且AZT可有效减少As2O3的使用剂量，但该过程是否是通过AZT促进HepG2细胞对As2O3的摄取来实现的尚不清楚。

2 AQP 9的结构、分布及功能

2.1 AQP 9的结构与分布

AQP9与其他水通道蛋白的结构基本类似，是一种跨细胞膜6次的单肽链，每个单肽链均为由295个氨基酸组成的单体，其相对分子质量约为31 kD，肽链的羧基端与氨基端均位于细胞内，共形成7个环，3个胞内环，4个胞外环[19]。AQP9的高级结构由同源四聚体构成，6个跨膜的α螺旋组成一个单体，该α螺旋构成了基本的含水通道，故AQP9具备通透水的作用[20]。Li等[21]研究发现，AQP9主要表达于肝脏组织和脂肪组织，其中AQP9在肝脏中的表达最为丰富，主要分布于面向门静脉的肝窦状隙质膜上，是肝脏最重要的水甘油通道。

2.2 AQP 9的功能

AQP9作为一种水通道蛋白，除了可以转运水以外还可以对甘油、氨、尿素、嘌呤及嘧啶等进行跨膜转运。Qiu等[22]实验表明，AQP9还参与了机体糖代谢、脂代谢、胆汁的分泌以及砷的代谢等；Loitto等[23]也报道，AQP9的高表达能够增加水分子的跨膜流动，从而迅速改变细胞内外渗透压，导致细胞发生形态学改变，形成伪足，该伪足可促使肿瘤细胞脱离原位而发生远处转移，因此AQP9参与了肿瘤的迁移过程。上述研究表明，AQP9参与了肝脏的众多生理和病理过程，在维持肝脏的正常生理功能及参与其病理环节中起着重要的作用。

3 AQP 9与肝癌的关系

既往有研究表明，与正常肝脏组织相比，AQP9在肝癌组织中呈现低表达，冉吕[24]研究发现，AQP9 mRNA和AQP9蛋白在肝癌组织中的表达比在癌旁组织中明显下降，对其做相关性分析表明，AQP9表达的下降程度与肝癌的转移程度呈正相关。Blum和Spangenberg[25]分析，正是由于AQP9的表达水平较低，才导致癌细胞对凋亡的抵抗性增强，从而恶性程度也就更高。Jablonski等[26]研究发现，肝癌组织中AQP9的表达水平相比于癌旁组织明显下降。Padma等[27]研究进一步表明，AQP9在肝脏正常组织中以肝中央静脉为中心呈带状分布样表达，但是在肝癌组织中其表达明显减少，进而推测AQP9在病理组织上表达的改变可能是源于肝细胞癌的特征性改变。除此之外，张文广等[28]报道，AQP9可能直接参与肝癌细胞的凋亡，进而影响肝癌的预后，用Hg2+选择性抑制水通道AQP9，发现引起肝细胞因渗透压改变所致的水通透是AQP9依赖性的，且该水通透直接与细胞的凋亡速度相关，抑制该通透可抑制凋亡小体的形成，相反的，AQP9过表达可增加肝癌细胞对水的通透作用，促进肝癌细胞凋亡。以上结果均表明，AQP9的表达水平可能直接影响着原发性肝癌的发生、发展及预后。

4 AQP 9在As 2 O 3联合AZT治疗肝癌中的作用

前期研究表明，As2O3的转运吸收及释放是通过芳基硫酸脂酶A、B，砷抵抗蛋白3，ATP结合盒式转运蛋白等完成的。但是，近期研究显示，As2O3还可通过AQP9出入细胞[29]，该现象可能是因为三价砷与甘油具有较相似的结构及电荷分布，因此可模仿甘油通过水-甘油通道AQP9进入细胞[30]。Liu等[31]研究表明，AQP9主要表达于肝脏组织及脂肪组织，是亚砷酸盐最高效的吸收通道。Mukhopadhyay等[32]研究发现，早幼粒细胞白血病HL60细胞系被过表达AQP9后，细胞对As2O3的敏感性增强。Leung等[33]对10个髓系和淋巴系白血病细胞株分别应用RT-qPCR和Western blotting的方法检测AQP9 mRNA及蛋白的表达量，结果表明：AQP9的表达量与As2O3诱导的细胞毒性呈正相关，在此基础上，进一步选择既不表达AQP9且对As2O3不敏感的Hep3B肝癌细胞株，转染EGFP-AQP9到该细胞株，上调AQP9的表达后发现，As2O3诱导的细胞毒性也相应增加了。利用同样的方法上调K562慢性粒细胞白血病细胞株中的AQP9表达后发现，该细胞内的As2O3浓度及其诱导的细胞毒性也随之显著增加，因此，可得出结论，即AQP9调控As2O3的转运及白血病细胞对As2O3的敏感性。Tang等[34]在肝癌HepG2细胞中导入AQP9过表达重组质粒，发现AQP9表达量增高时，可提高As2O3对肝癌细胞的增殖抑制作用，促进caspase 3的活化以促进细胞凋亡，并抑制细胞的迁移和侵袭。以上结果与本课题组通过As2O3与AZT联合用药对肝癌HepG2细胞产生的生物学行为相吻合。

综上所述，在As2O3与AZT联合治疗肝癌的过程中，AZT扮演着As2O3增敏剂的重要角色，其在协同抑制人肝癌HepG2细胞的增殖、侵袭、转移及促进人肝癌HepG2细胞凋亡的基础上大大地减少了As2O3的使用剂量，起到了减毒增效的作用。AZT的As2O3增敏作用可能与其影响AQP9的表达有关，其可能通过上调AQP9的表达增加肝癌细胞对As2O3的敏感性，从而促进As2O3的吸收，提高As2O3的利用效率。

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