陈亮，乔红梅，杨永宏，李芳琴

西安医学院附属宝鸡医院肿瘤科，陕西宝鸡7210060

乳腺癌是一种常见的危害女性身体健康的恶性肿瘤，其发病率逐年上升，是导致女性死亡的主要原因。据报道，2015年新增乳腺癌病例约为23万[1]，严重影响女性的身体健康和生命安全，因此加强对乳腺癌的诊断与治疗是亟需解决的问题。目前，乳腺癌的治疗手段主要有化疗、放疗、手术治疗等。临床研究表明，化疗对乳腺癌的治疗起着重要作用，对术前、术后乳腺癌患者实行化疗，可有效提高乳腺癌的治疗效果[2-3]。近年来，随着药理学的发展，一些药物逐渐用于治疗乳腺癌，但易产生耐药性，增加了乳腺癌治疗的难度，使其无法达到预期治疗效果[4]。本研究探讨了长春瑞滨联合依维莫司对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制，旨在为乳腺癌的治疗提供新的思路与方法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳腺癌细胞MCF-7购自美国模式菌种收集中心；长春瑞滨、依维莫司、RPMI 1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司；噻唑蓝（MTT）、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒均购自南京碧云天生物技术有限公司；40只雄性裸鼠（体重15～20 g）购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号为SCXK（京）2009-0004；磷脂酰肌醇-3激酶（phospoinositide 3-kinase，PI3K）单克隆抗体、磷酸化PI3K（p-PI3K）单克隆抗体、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1（serine/threonine kinase 1，AKT1）单克隆抗体、磷酸化AKT1（p-AKT1）单克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体均购自美国Sigma公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠二抗、CO2培养箱均购自美国Thermo公司；流式细胞仪购自美国BD公司；电泳槽购自美国Bio-rad公司；凝胶成像系统购自法国Vilber Lourmat公司。

1.2 细胞培养

将复苏后的乳腺癌细胞培养于RPMI1640培养基中，加入10%胎牛血清和100 μg/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，放入37℃、5%CO2的培养箱中，次日更换新鲜培养基继续培养，待细胞汇合度达到80%～90%时，使用0.25%胰酶消化，按1∶2的比例进行传代，在倒置显微镜中每天观察细胞的生长状态。

1.3 MTT检测细胞的存活率

将长春瑞滨、依维莫司的浓度分别稀释为5、10、20、40、60 μg/ml，分别计算依维莫司和长春瑞滨的半数抑制浓度（IC50），作为后续依维莫司组、长春瑞滨组及联合组的药物浓度。以每孔1×104个细胞接种于96孔板中，在细胞培养箱中培养过夜，加入长春瑞滨、依维莫司处理细胞，以不加药物处理的细胞为对照组，置于CO2培养箱中培养48 h，每孔加入20 μl MTT溶液，孵育4 h后终止培养，弃上清，每孔加入150 μl DMSO溶液，置于酶标仪上检测细胞在570 nm波长下的吸光值（OD值），取平均值，计算细胞的存活率。实验重复3次。

1.4 流式细胞术检测细胞的凋亡率

收集各组细胞，采用磷酸盐缓冲液（PBS）将细胞浓度调整为 1×105/ml，加入 5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，混匀，室温下避光反应15 min，在流式细胞仪上检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.5 裸鼠成瘤动物模型的制备

取生长状态良好的细胞，采用PBS进行清洗，收集细胞，用无血清培养基与Matrigel胶按3∶1的比例混合重悬细胞，将细胞浓度调整为5×105/100 μl，取100 μl细胞悬液注射至裸鼠右侧腹股沟处。饲养条件为20～25℃，自由进食水。待肿瘤大小约为300 mm3时，随机分为4组，每组10只，采用腹腔注射给药法。对照组注射等量生理盐水；长春瑞滨组按裸鼠体重计算给药剂量，2 mg/kg，qd；依维莫司组按裸鼠体重计算给药剂量，2 mg/kg，q3d；联合组注射长春瑞滨（2 mg/kg，qd）+依维莫司（2 mg/kg，q3d）。4组小鼠均腹腔注射，连续注射15 d，测量肿瘤体积和重量。剥离肿瘤，称取重量，用游标卡尺测量肿瘤的长径（A）及短径（B），并按公式V=AB2/2计算肿瘤体积。

1.6 Western blot法检测细胞中PI 3 K、p-PI 3 K、AKT 1、p-AKT 1蛋白的表达水平

胰酶消化并收集对数生长期细胞，以1×106个细胞接种于培养皿中，细胞贴壁后，使用不同浓度的药物干预细胞，培养24 h，取出培养皿，冰上静置，采用PBS清洗2次，加入80 μl细胞裂解液，混匀，吸出上清，根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度。加入5×SDS上样缓冲液，煮沸5 min。配制相应浓度的分离胶和浓缩胶，插入梳子，避免产生气泡。取10 μl蛋白样品加入上样孔，80 V电泳20 min后将电压调整为120 V继续电泳，待溴酚蓝到达分离胶底部时，停止电泳。将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，使用封闭液室温封闭2 h，加入适当稀释浓度的一抗，4℃孵育过夜，TBS/T清洗2次，每次10 min，加入适当稀释浓度的二抗，室温孵育2 h，TBS/T清洗2次，每次10 min，滴加ECL化学发光液，显影1～2 min，冲洗，晾干，采用凝胶成像系统扫描分析相应蛋白的灰度值，与GAPDH的比值为蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 长春瑞滨联合依维莫司对细胞存活率的影响

随着长春瑞滨或依维莫司药物作用浓度的增加，细胞的存活率逐渐下降，且呈一定的浓度依赖性（P＜0.01）。与对照组相比，5、10、20、40、60 μg/ml的长春瑞滨或依维莫司均可降低乳腺癌细胞的存活率。经软件分析，长春瑞滨和依维莫司作用于人乳腺癌MCF-7细胞48 h的IC50浓度分别为21.92 μg/ml和30.46 μg/ml。长春瑞滨组、依维莫司组、联合组的细胞存活率均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；联合组的细胞存活率低于长春瑞滨组和依维莫司组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1～表3）

表1 不同浓度长春瑞滨对乳腺癌细胞存活率的影响（ n= 3，x-± s）

表2 不同浓度依维莫司对乳腺癌细胞存活率的影响（ n= 3，x-± s）

表3 长春瑞滨联合依维莫司对乳腺癌细胞存活率的影响（ n= 3，x-± s）

2.2 长春瑞滨联合依维莫司对细胞凋亡率的影响

长春瑞滨组、依维莫司组、联合组的细胞凋亡率均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；联合组的细胞凋亡率高于长春瑞滨组和依维莫司组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图1、表4）

图1 各组细胞的凋亡率

表4 长春瑞--滨联合依维莫司对乳腺癌细胞凋亡率的影响（ n= 3，xx± s）

2.3 长春瑞滨联合依维莫司对肿瘤体积和重量的影响

长春瑞滨组、依维莫司组、联合组的肿瘤体积和重量均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；联合组的肿瘤体积和重量均低于长春瑞滨组和依维莫司组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表5）

表5 长春瑞滨联合依维莫司对肿瘤体积和重量的影响（x-± s）

2.4 Western blot检 测 细 胞 中PI 3 K、p-PI 3 K、AKT 1、p-AKT 1蛋白的表达水平

对照组、长春瑞滨组、依维莫司组、联合组细胞的PI3K、AKT1蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；长春瑞滨组和联合组细胞的p-PI3K、p-AKT1蛋白表达水平均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；长春瑞滨组细胞的p-PI3K、p-AKT1蛋白表达水平均低于依维莫司组，高于联合组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图2、表6）

图2 Western blot结果图

表6 长春瑞滨联合依维莫司对细胞PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT AKT1蛋白相对表达水平的影响（n=3，，±s）

表6 长春瑞滨联合依维莫司对细胞PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT AKT1蛋白相对表达水平的影响（n=3，，±s）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与长春瑞滨组比较，P＜0.05

组别对照组长春瑞滨组依维莫司组联合组F值P值0.528±0.069 0.578±0.055 0.525±0.061 0.531±0.078 0.430＞0.05 0.510±0.048 0.257±0.031a 0.614±0.062b 0.135±0.012a b 113.704＜0.01 0.942±0.068 0.955±0.058 0.948±0.062 0.962±0.075 0.052＞0.05 0.574±0.055 0.459±0.033a 0.668±0.052b 0.212±0.024a b 89.511＜0.01 PI3K p-PI3K AKT1p-AKT1

3 讨论

乳腺癌多发于女性，发病率较高，且近年来呈年轻化趋势。乳腺癌的产生主要是由于原位癌细胞与正常细胞之间的黏附性降低，导致原位癌细胞易脱落至血液或淋巴液，从而危害患者的生命安全，临床上表现为乳腺肿块，皮肤改变，乳头、乳晕异常等。乳腺癌的临床症状不明显，不易被发现，临床上常采取手术结合化疗的方式进行治疗，但部分患者易出现耐药现象，严重影响治疗效果和预后。因此，研究新的化疗药物或方案成为目前乳腺癌研究的热点之一。长春瑞滨可以与细胞有丝分裂的微管蛋白相结合，阻止双微体聚合形成微管，能有效抑制癌细胞的有丝分裂，从而抑制癌细胞的生长[5]。研究表明，长春瑞滨对神经的影响较小，具有安全、可靠的治疗效果[6-7]。临床研究表明，长春瑞滨对非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌具有高效的治疗效果[8]。另有研究表明，长春瑞滨与曲妥珠单抗联合治疗乳腺癌具有较好的疗效[9]。目前，哺乳动物中的雷帕霉素信号通路是研究的热点之一，激活的雷帕霉素可促进真核起始因子发生磷酸化，提高翻译水平，从而促进细胞增殖。依维莫司可有效抑制雷帕霉素的活性，具有抑制细胞生长、促进细胞凋亡的作用[10]。本研究探讨长春瑞滨联合依维莫司对乳腺癌细胞增殖、凋亡、瘤体生长的影响。结果显示，长春瑞滨、依维莫司均可抑制乳腺癌细胞的增殖，诱导其凋亡，且呈一定的浓度依赖性。

裸鼠成瘤实验常用于研究人类恶性肿瘤的基础理论和临床意义，裸鼠具有可稳定生长、性能稳定、易剥离等特点[11-12]。本实验选取健康的裸鼠，将裸鼠右侧腹股沟处作为肿瘤细胞的接种靶点。结果表明，长春瑞滨、依维莫司能够在一定程度上有效抑制乳腺癌细胞MCF-7裸鼠种植瘤的生长。

PI3K是一种磷脂酰激酶，广泛存在于细胞质内，受多种细胞因子受体的影响。PI3K可以磷酸化磷脂酰肌醇，从而发挥细胞调节作用[13]。AKT是PI3K的下游靶基因，能被多种转录因子直接或间接磷酸化，调控下游靶基因的转录[14-15]。活化的AKT可激活雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of repamycin，MTOR），调控肿瘤细胞的侵袭、转移、化疗耐药等过程，其主要作用是促进细胞增殖，抑制细胞凋亡[16-17]。依维莫司是MTOR抑制剂，研究表明，依维莫司可阻断MTOR磷酸化，发挥抑制细胞周期和细胞生长，促进细胞凋亡的作用[18-20]。本实验中，依维莫司对乳腺癌细胞中PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT1表达水平的影响不明显，表明依维莫司对MTOR上游调控因子无明显的调节作用。长春瑞滨对乳腺癌细胞中PI3K、AKT1的表达水平没有明显的调节作用，但可促进p-PI3K、p-AKT1表达下调。两者联合使用可进一步降低p-PI3K和p-AKT1的表达水平，提示依维莫司有可能具有加强长春瑞滨抑制PI3K/AKT1信号通路的作用。

综上所述，长春瑞滨和依维莫司主要通过调控PI3K/AKT1信号通路抑制乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡，从而有效抑制肿瘤生长，且联合作用的效果更好。

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