饶大庞　虞海峰　王帅彬　孙来芳

[摘要] 目的 探讨miRNA-149抑制膀胱癌细胞侵袭的可能分子机制。 方法 采用PolyJetTMDNA In Vitro Tranfection Reagent将miRNA-149 过表达质粒稳定转染膀胱癌细胞T24、T24T，并用荧光定量PCR技术检测转染率；利用免疫蛋白印迹法检测EMT标志蛋白及miRNA-149下游靶基因IGFBP5和PDGFRA蛋白的表达。 结果 在T24、T24T细胞中成功过表达miRNA-149，且差异具有统计学意义（P<0.05）。miRNA-149显著抑制膀胱癌细胞EMT发生，从而抑制膀胱癌细胞侵袭。进一步机制研究发现miRNA-149可抑制其下游靶基因IGFBP5和PDGFRA蛋白的表达。 结论 该研究表明miRNA-149抑制膀胱癌侵袭可能与EMT的发生及其下游基因IGFBP5和PDGFRA的表达密切相关，为临床膀胱癌的转移研究提供了新的启示。

[关键词] 膀胱癌；miRNA-149；侵袭；EMT；IGFBP5；PDGFRA

[中图分类号] R737.14 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）26-0038-04

Study on the preliminary molecular mechanism of miRNA-149 inhibiting bladder cancer cell invasion

RAO Dapang YU Haifeng WANG Shuaibin SUN Laifang

Department of Urinary Surgery， the Second Affiliated Hospital and Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To investigate the possible molecular mechanism of miRNA-149 inhibiting the invasion of bladder cancer cells. Methods miRNA-149 overexpression plasmid was stably transfected into bladder cancer cells T24， T24T using PolyJetTM DNA In Vitro Tranfection Reagent， and the transfection rate was detected by real-time PCR； the expression of EMT marker protein and miRNA-149 downstream target genes IGFBP5 and PDGFRA proteins were detected by Western blot method. Results miRNA-149 was successfully overexpressed in T24 and T24T cells， and the difference was statistically significant（P<0.05）. miRNA-149 significantly inhibited the occurrence of EMT in bladder cancer cells， thereby inhibiting the invasion of bladder cancer cells. Further mechanism studies found that miRNA-149 inhibited the expression of its downstream target genes IGFBP5 and PDGFRA proteins. Conclusion This study demonstrates that miRNA-149 inhibition of bladder cancer invasion may be closely related to the occurrence of EMT and the expression of downstream genes IGFBP5 and PDGFRA， providing new insights for the study on clinical bladder cancer metastasis.

[Key words] Bladder cancer； miRNA-149； Invasion； EMT； IGFBP5； PDGFRA

膀胱癌是我國最常见恶性肿瘤之一，居泌尿系统恶性肿瘤之首位，且近年来其发病率有上升趋势。男性发病率是女性的3～4倍，男性膀胱癌的发病率居全身肿瘤第8位，女性排在第 12 位以后[1，2]。近年来，我国部分城市肿瘤发病率报告显示膀胱癌发病率有增高趋势[3]。攻克膀胱癌已成为保护广大人民群众的身体健康、提高人民群众的生活质量的必然要求。而肿瘤的转移涉及肿瘤细胞一系列细胞生物学行为，其中肿瘤细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肿瘤转移的第一步，然而其分子机制尚未充分研究[4]。

近年来，miRNA在肿瘤发生、发展和转移中发挥重要作用。其中miRNA-149被报道参与肿瘤细胞的EMT、侵袭和转移过程[5-6]。然而未见miRNA-149在膀胱癌转移中的相关报道。我们课题组前期研究发现miRNA-149在膀胱癌组织和细胞中表达降低，miRNA-149过表达可显著抑制膀胱癌细胞侵袭，因此本研究将进一步探讨miRNA-149抑制膀胱癌细胞侵袭的分子机制。

1 材料与方法

1.1主要材料与试剂

人膀胱癌细胞株 T24、T24T由本实验室保存。DMEM/Ham's F-12（1：1 volume）培养基购于美国GIBCO公司，细胞总RNA提取試剂盒购自美国QIAGEN公司，荧光定量PCR试剂盒购自美国QIAGEN公司，转染试剂盒PolyJetTM DNA In Vitro Transfection Reagent购自美国Sigma 公司，LV3-pGLV -h1-GFP-puro-Mir-149-5p-pre以及对照质粒均购自上海吉玛制药技术有限公司，β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PDGFRA、IGFBP5抗体均购自Abcam公司。

1.2 细胞株的培养、转染和分组

实验用所有细胞株均使用含5%胎牛血清的DMEM/Ham's F-12（1：1 volume）培养基，并置于37℃ 5% 的CO2培养箱中培养。

1.3 构建miRNA-149稳定过表达膀胱癌细胞

转染前1天将T24、T24T细胞种于6孔板中，待细胞生长至70%左右进行转染。转染前 1 h，弃掉培养基，用PBS洗一次，加入1 mL不含血清，不含抗生素DMEM 培养基。将目的质粒（3 μg）和 PolyJetTM（9 μL）分别加入到50 μL DMEM 培养基中，混匀后电转。室温静置10～15 min，然后将混合液逐滴加入相应孔中，轻轻晃动6孔板至均匀后置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。24 h后采用嘌呤霉素进行筛选，待克隆形成后提取RNA并采用荧光定量PCR技术检测转染率。

1.4 Western Blot检测miRNA-149 过表达对膀胱癌细胞中EMT的影响

将miRNA-149过表达细胞和对照细胞分别种于6孔板中，48 h后提取细胞蛋白，检测EMT相关标志物的表达水平。

1.5 Western Blot检测miRNA-149 过表达细胞中靶基因PDGFRA、IGFBP5的表达

使用TargetScan在线软件预测miRNA-149的靶基因，我们发现PDGFRA、IGFBP5的3UTR区域分别包含一个保守的miRNA-411 的靶位点。于是将miRNA-149过表达细胞和对照细胞分别种于6孔板中，48 h后提取细胞蛋白，检测PDGFRA、IGFBP5的表达水平。

1.6 统计学方法

采用 SPSS18.0 统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，利用t检验方法检测两组之间的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-149 稳定转染膀胱癌细胞对miRNA-149表达量的影响

本研究采用PolyJetTM将miRNA-149成熟体质粒及其对照载体转染膀胱癌T24、T24T细胞，经筛选后采用荧光定量PCR技术检测miRNA-149的表达情况。结果表明在T24细胞（P=0.0390）、T24T细胞（P=0.0392）成功过表达miRNA-149，且差异具有统计学意义，见表1、图1A、1B。

2.2 miRNA-149过表达对膀胱癌细胞EMT的影响

为进一步研究miRNA-149抑制膀胱癌细胞侵袭的潜在机制，本文采用Western Blot技术检测miRNA-149过表达组与对照组中EMT的相关标志蛋白的变化。结果显示，与对照组相比，T24-miRNA-149、T24T-miRNA-149细胞中上皮性标志物E-cadherin、β-catenin表达明显升高，而间质性标志物N-cadherin、Vimentin表达明显降低，见图2。因此该结果表明miRNA-149显著抑制膀胱癌细胞EMT发生，从而抑制膀胱癌细胞侵袭。

2.3 miRNA-149对下游基因PDGFRA、IGFBP5的影响

使用 TargetScan在线软件预测 miRNA-149的靶基因，发现PDGFRA、IGFBP5的3UTR 区域分别包含一个保守的miRNA-411 的靶位点。接着采用Western Blot实验发现miRNA-149过表达可显著抑制PDGFRA、IGFBP5蛋白的表达，见图3。因此miRNA-149可能通过抑制其下游基因PDGFRA、IGFBP5蛋白的表达从而抑制膀胱癌细胞侵袭。

3 讨论

膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一[7]，其发生发展与多种因素相关，涉及遗传和环境因素，然而分子机制研究尚未完全清楚[8-9]。研究显示，出现区域或远处转移的膀胱癌患者的5年生存率仅45%和6%[10]。肿瘤转移是肿瘤从一个器官播散到不相邻的另一个器官，一般认为转移是实体肿瘤进展的最后一步，是肿瘤患者死亡的最重要原因[11]，因此，膀胱肿瘤早期诊断、治疗对于提高预后非常重要。近年来，随着恶性肿瘤发生和复发风险的分子标记物研究的开展，肿瘤的转移涉及肿瘤细胞一系列细胞生物学行为，其中肿瘤细胞上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）发挥重要作用[12-13]。研究表明miRNA在包括膀胱癌等癌灶中普遍存在，且与癌旁组织存在差异表达，miRNA可作为肿瘤抑癌基因或促癌基因，参与膀胱癌细胞周期进程、细胞凋亡、侵袭和转移的多个步骤过程[14-19]。

miR-149（GenBank ID：406941；miRBase ID：MI00 00478）是近年来新发现的miRNA，定位于2q37.3，成熟的miR-149-5p长23nt，miR-149-3p长21nt[20]。已有研究发现，miR149-3P可以通过靶向S100A4在UM-UC-3膀胱癌细胞系中发挥抑癌作用[21]。也有文献报道miRNA-149可以靶向FOXM1基因，从而参与TGF-β1诱导的EMT[5，22]。E-cadherin、β-catenin是上皮性标志物，N-cadherin、Vimentin是间质性标志物，通过检测该标志物表达的变化可预测EMT的发生[23]。本研究发现miRNA-149在膀胱癌组织和细胞中显著降低，进一步研究显示膀胱癌细胞过表达miRNA-149可抑制间质性标志物N-cadherin、Vimentin表达，上调上皮性标志物E-cadherin、β-catenin表达，因此，miR-149抑制膀胱癌细胞侵袭可能与抑制EMT发生有关。miRNA149 主要通过与靶基因的3UTR结合从而发挥促癌或抑癌的作用。IGFBP5、PDGFRA都是膀胱癌的抑癌基因[24，25]。文献报道膀胱癌标本和细胞系与INSR/IGF1R的活化呈负相关，具有IGF1R酪氨酸的抗增殖功效激酶抑制剂，提示IGFBP5在膀胱癌细胞中的表达、INSR/IGF1R受体的激活以及IGF1R酪氨酸酶抑制剂的抗肿瘤作用之间存在相关性，提示IGFBP5的低表达可作为预测抗IGF1R或抗IGF1R配体治疗膀胱癌的标志物[24]。PDGFRA基因编码血小板衍生生长因子家族成员的细胞表面酪氨酸激酶受体，这些生长因子是间充质来源细胞的有丝分裂原，与受体结合的生长因子的同一性单体确定功能性受体是由血小板衍生生长因子受体α和β多肽组成的同二聚体还是异二聚体[26]。本实验发现miRNA-149 的靶基因PDGFRA、IGFBP5的3UTR区域分别包含一个保守的miRNA-149的靶位点，并且miRNA-149抑制其下游基因PDGFRA、IGFBP5蛋白的表达，miRNA-149抑制EMT可能与其下游靶基因相关，为miRNA-149作为膀胱癌转移新的靶标提供了重要的基础，具有重要的临床意义。

然而miR-149作用后IGFBP5和PDGFRA的下游基因表达，miR-149对IGFBP5和PDGFRA的下游信号通路的调节及这种调节在膀胱癌细胞迁移、侵袭和EMT中的作用等，尚需要進一步的探索，同时也是本文的不足。未来我们将深入研究该部分内容，为miRNA-149在临床膀胱癌的防治应用提供新的策略。

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（收稿日期：2018-03-05）