杨智超，宋丽娟，姜维佳，宋俊丽，王 青

（1.山西中医药大学，山西太原030024； 2.山西医科大学第二附属医院，山西太原030001）

葡萄籽提取物（grape seed extract，GSE）是从葡萄籽里提取到的天然产物，富含黄酮类化合物，此黄酮类化合物主要包括黄烷-3-醇结构的儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯，以及由黄烷-3-醇通过碳-碳键结合聚合而成的原花青素［1-2］。原花青素根据聚合度的不同分为原花青素高聚体（polymeric proanthocyanidin，PPCs）和原花青素低聚体（oligomeric proanthocyanidin，OPCs）。原花青素单聚体和二聚体生物活性最强，具有透过血脑屏障的优良特性，能顺利到达中枢病灶部位，为治疗中枢神经系统疾病的药物，具有很大的发展潜力［3-4］。

除葡萄籽外，绿茶、巧克力、可可和多种水果当中都含有大量的黄烷醇类化合物和原花青素。而大量的文献报道也证明了这些黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、抗炎和免疫调节的能力，还可以通过降低血管的通透性和脆性，防止血管损伤［5-7］。流行病学的调查结果也显示，食用黄烷醇类和花青素类营养补充剂可以大大降低冠心病和脑卒中的发病率［8-9］。而且原花青素还可以保护氧化应激引起的胃黏膜和胶质细胞损伤。综上所述，由于这些黄酮类化合物对身体健康的潜在益处，使其受到了广泛关注，但这些化合物的安全性还需要考察。本实验研究了葡萄籽提取物及其主要成分对PC12神经元细胞的毒性，为其在神经领域的广泛应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

CO2培养箱（Thermo），全波长酶标仪，小型垂直电泳槽（Bio-Rad），小型半干转膜仪（Bio-Rad），小型基础通用电源（Bio-Rad），凝胶成像系统（Bio-Rad），DMEM培养基（Gibco），胎牛血清（HyClone），噻唑蓝（碧云天），PVDF膜（milipore），BCA试剂盒（碧云天），RAPI细胞裂解液（碧云天），ECL（碧云天），小鼠Bcl-2抗体（Bioworld），小鼠Bax抗体（Bioworld），辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗（康为世纪）。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT实验 用含有10%FBS的高糖DMEM培养高分化的PC12神经元细胞，取96孔细胞培养板，每孔加5×105/mL 细胞 100 μL 培养12 h；浓度为 2.5 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，30 μg/mL，50 μg/mL 和 100 μg/mL 的葡萄籽总提物分别孵育PC12神经元24 h、48 h和72 h，每孔加10 μL 5%MTT 培养 4 h，每孔加入 100 μL DMSO溶解，采用全波长酶标仪以490 nm为检测波长，测定其OD值。空白对照组为等体积的培养液。1.2.2 Western Blot实验 PC12神经元细胞用30 μg/mL的葡萄籽总提物孵育24 h后，收集细胞加入RAPI细胞裂解液，提取细胞总蛋白，蛋白浓度用BCA试剂盒检测。蛋白上样量为20 μg，12%的聚丙烯酰胺凝胶。

1.3 统计学方法

应用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，P<0.05为差异具有统计学意义。结果用（±s）表示。单因素方差分析（One-WayANOVA）后用Dunnett′s test分析比较组间差异。两组间比较采用T-test法。

2 结果

2.1 PC-12神经元细胞增殖实验

葡萄籽提取物（2.5 μg/mL 和 10 μg/mL）随着作用时间延长，可以促进PC12细胞的增殖，而10 μg/mL的葡萄籽提取物对PC-12神经元增殖无影响。20 μg/mL的葡萄籽提取物作用48 h后表现出显著的细胞毒性。30 μg/mL，50 μg/mL 和 100 μg/mL作用24 h就可显著抑制PC-12细胞的增殖。结果见图1。

图1 GSE对PC12细胞增殖的影响

2.2 30 μg/mL GSE对 PC-12神经元 Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

30 μg/mL葡萄籽提取物作用24 h，可以减少抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达，而对促凋亡蛋白Bax的表达无影响。结果见图2。

3 讨 论

图2 30 μg/mL GSE对PC-12神经元Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

本研究显示低浓度（2.5 μg/mL，5 μg/mL）的葡萄籽提取物可促进PC12细胞增殖，10 μg/mL的葡萄籽提取物对PC12细胞增殖无影响，当浓度升高到20 μg/mL时葡萄籽提取物作用48 h可显著抑制PC12细胞增殖，而高浓度（30 μg/mL，50 μg/mL和100 μg/mL）的葡萄籽提取物孵育24 h就能显著抑制PC12细胞增殖。由此可见，低剂量、长期作用的葡萄籽提取物无细胞毒性，但随着剂量增加表现出显著的细胞毒性。提示，葡萄籽提取物可能含有致细胞毒性的成分，长期大量服用可能会损害人体健康。因此，葡萄籽提取物作为药品、保健品和化妆品广泛应用的同时，一定要注意药物的使用剂量和时间，以保证用药安全、有效［10］。

本研究对葡萄籽提取物细胞毒性的机制进行了初步探讨，细胞凋亡是受一系列基因控制的程序化的细胞死亡方式，被内源性或外源性的凋亡信号触发后，可调节细胞内编码的自杀相关的凋亡蛋白发生［11］。Bcl-2蛋白家族是调节细胞凋亡的一类蛋白，分为抗细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL等和促凋亡蛋白 Bax、Bak 等［12］。研究证明，Bcl-2 被 Bax络合，其抗凋亡作用会减弱。因此，Bcl-2表达下调或Bax蛋白升高均会促进细胞凋亡［13］。本研究发现，30 μg/mL的葡萄籽提取物可以通过抑制Bcl-2蛋白的表达诱导细胞凋亡，是其产生细胞毒性的重要作用机制。

大量文献报道，葡萄籽原花青素及其单体成分儿茶素、表儿茶素和原花青素B1等具有较高的食用安全性，急性毒性和慢性长期毒性实验均未见毒副作用［10］。葡萄籽原花青素具有可预防保护砷致小鼠肝脏毒性，可诱导恶性肿瘤细胞凋亡和保护化疗药物所致的细胞损伤等作用［14-16］。因此，葡萄籽提取物日益被各国广泛用作营养补充剂来使用。但本研究发现，葡萄籽提取物大量使用会诱导细胞凋亡，表明其中除原花青素外，还含有其他有毒成分。因此，我们在对葡萄籽原花青素进行限量的同时，也应当对其他成分进行质控，以保护药物能够安全、有效地在临床使用。