刘 倩，彭 琪，谢明玉，蒋再学，陆小梅，赖 茅，陈秀英

(1.东莞市儿科研究所，广东 东莞 523325；2.东莞市儿童医院，广东 东莞 523325；3.广东药科大学附属第一医院中心实验室，广东 广州 510080)

本文通过利用肠道病毒71型(EV71)阳性患者抗血清进一步对动物模型的中和表位肽进行筛选，研究动物中确定的表位肽与人抗血清的反应特征，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料：本研究选择2014年11月～2015年6月东莞市儿童医院手足口病入院患儿，经Taqman荧光探针PCR检测为肠道病毒通用型阳性，且EV71阳性的急性感染患儿。

1.2多肽序列及偶联：本研究选取小鼠和兔子动物模型筛选到的三个EV71中和表位肽SP55、SP70、VP2-28，并应用MEGA5.0软件将多肽序列与中国流行EV71的C4亚型进行序列比对。

1.3研究方法

1.3.1体外微量中和实验：取50 μl患儿血清按倍比稀释至96孔板中，加入100 TCID50 EV71病毒50 μg，37℃孵育1 h，加入Vero细胞，2×104细胞/孔。5% CO2，37℃培养4 d。观察病变情况，以未发生病变的最大稀释度作为血清的抗病毒滴度。

1.3.2酶联免疫反应：合成多肽使用碳酸缓冲液稀释至5 μg/ml，50 μl/孔，4℃包被过夜。2%BSA 37℃封闭1 h。弃封闭液，血清标本20 μl用含1%BSA的抗体稀释液按4倍稀释7个梯度，每孔加入抗体100 μl，每孔3个平行，37℃孵育1 h。PBST洗涤6次，5 min/次。羊抗人IgG二抗以及羊抗人IgM二抗用抗体稀释液按1∶1 000稀释，并等体积混合，每孔加入二抗100 μl，37℃孵育1 h，PBST洗涤6次，5 min/次。

2 结果

2.1EV71急性感染患儿血清采集：本研究从2014年11月～2015年6月，在EV71急性感染患儿的血清样本中，经过体外微量中和实验，筛选到13个中和抗体滴度较高的血清样本。其中中和抗体滴度为2 048倍的8个，4 096倍的4个，8 192倍的1个。

2.2EV71中和表位多肽序列比对、合成及偶联：分别在3个表位肽的N端和C端进行BSA偶联，N端记为B-SP70、B-SP55和B-VP2-28，C端记为SP70-B、SP55-B以及VP2-28-B。见表1。

多肽名称参考序列合成序列SP55PESRESLAWQTATNPPDSRESLAWQTATNPSP70YPTFGEHKQEKDLEYYPTFGEHKQEKDLEYVP2-28AGGTGTEDSHPPYKQAGGTGTEDTHPPYKQ

2.3ELISA分析抗血清中EV71抗体滴度：通过ELISA对人抗血清中EV71的抗体滴度进行分析，发现随着抗血清的中和滴度从2 048倍升高到8 194倍，EV71的抗体滴度也随之增高。见图1。

图1 EV71抗血清中和抗体滴度与病毒抗体滴度趋势分析

2.4ELISA分析EV71动物模型中和表位肽在人抗血清中的抗体滴度：将偶联有BSA的中和表位肽SP55、SP70和VP2-28通过ELISA的方法分析人抗血清中各多肽的抗体滴度。见图2。

A：中和表位肽SP55在人抗血清中的滴度；B：中和表位肽SP70在人抗血清中的滴度；C：中和表位肽VP2-28在人抗血清中的滴度；D：中和表位肽SP55-B、B-SP70以及B-VP2-28在人抗血清中的滴度比较图2 N端和C端偶联对多肽抗体滴度的影响

3 讨论

EV71病毒属于微小病毒科，无包膜的RNA病毒。病毒有4个衣壳蛋白VP1～4，其中VP1～3构成衣壳的表面，而VP4与基因组RNA结合。12个VP1～3的五聚体构成二十面体的立体对称结构[1-2]。EV71型病毒所致的手足口病(Hand foot and mouth disease，HFMD)极易发生严重并发症造成严重的不良结局[3]。不断研究和探索EV71型病毒基因型及抗体对疾病的发病机制、疫苗研制以及临床治疗均具有重要的临床意义和价值[4]。

表位肽SP55和SP70是EV71中较为重要的线性中和表位，但是由于其作用机制尚未明确，并且SP55和SP70在EV71病毒感染后能否诱导机体产生抗体反应仍存在一定的争议[5]。Foo等人在基础实验中表示，二者可诱导机体的抗体反应[6]，而在潘青松的研究中表示，二者不能诱导相应的中和抗体反应[7]。此外研究证实，VP2-28是VP上与E1反应强烈的肽链之一[8]，VP2-28对应的单抗是MAB979，而MAB979对多种不同的基因型EV71病毒均具有交叉中和效应，提示BP2-28是一个具有一定临床研究价值的交叉中和表位肽，但VP2-28在诱导中和抗体中的作用及机制仍需进一步研究[9-10]。

本文综合分析三个多肽在EV71阳性患者抗血清中的抗体滴度以及抗血清的中和滴度，发现EV71的中和抗体水平会随着EV71总抗体水平的升高而升高。SP55肽无论在N端还是C端偶联牛血清白蛋白BSA都具体较高的抗体滴度，但SP55肽C端偶联BSA的抗体滴度随着抗血清的中和滴度的升高而升高。SP70肽在人抗血清中的抗体滴度普遍不高，其中N端偶联的SP70肽好于C端偶联，VP2-28肽N端偶联BSA的抗体滴度普遍高于C端偶联。三个多肽中VP2-28和SP55在抗血清中具有更高的抗体滴度：VP2-28肽在抗血清中的抗体滴度最高，由以N末端偶联BSA的VP2-28肽的抗体滴度为高。

本文通过EV71阳性患者的抗血清来初步对动物模型中试验成功的中和表位肽进行筛选，去掉抗体滴度低的多肽，从而提高多肽疫苗在人体试验的成功率，降低成本。