霍奕安，刘荣荣，胡秀彩，吕爱军，孙敬锋，陈成勋

（1. 天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384；2. 天津农学院创新创业实验室，天津 300384）

锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）又称为鲤科疱疹病毒3型（CyHV-3），是引起高度传染性锦鲤疱疹病毒病（KHVD）的病原[1-3]。1998年KHV首次在以色列和美国引发疫情，2002年在我国广东省被发现，随后陆续到传播到我国其他地区。至今已有30多个国家或地区陆续报道发生该病[4]。KHVD潜伏期长，突发性高，给鲤鱼养殖业造成了严重危害。目前来自不同国家的4个KHV DNA全基因序列已被测序[5]。病毒检测和减毒疫苗免疫是KHVD最主要的控制措施[6]。

锦鲤是我国观赏鱼的主要养殖品种之一，在国内淡水养殖鱼类中占很大比例，一旦暴发KHVD，往往带来巨大经济损失，所以开展KHV相关研究十分重要。2017年6月，天津市滨海新区、北辰区等一些养殖场的锦鲤陆续大量发病死亡，3 d内死亡率高达85%。病鱼表现烂鳃、鳃丝发白、鳞片脱落等症状，以及内脏器官出血、糜烂等剖检病变，疑似感染KHV。本研究根据KHV基因序列分别设计合成TK、SphI-5、ORF25、ORF56和ORF81基因特异性引物，采用PCR技术检测KHV相关功能基因，为KHVD诊断及流行病学分析提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验鱼、试剂及仪器

试验鱼：天津市滨海新区、北辰区等一些养殖场送检的发病锦鲤，平均体长为（6±0.5）cm；试剂及仪器：DL 2 000 bp DNA Marker（天津生工生物公司），DNA提取试剂盒、PCR Master Mix（天根生化科技有限公司），Buffer蓝DNA染料（北京鼎国昌盛生物技术公司），PCR扩增仪（德国Analytikjena公司）。

1.2 引物设计与合成

根据GenBank数据库登录的KHV TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因序列（AP008984.1），利用Primer Premiers 5.0软件设计特异性引物（表1）。……