王琛　张永乐　潘克女

[摘要] 目的 探討慢性乙型肝炎患者外周血中T细胞受体重排删除环（TRECs）含量以及CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴细胞亚群表达的临床意义。 方法 流式细胞技术与实时荧光定量PCR技术分别检测32例轻度慢乙肝患者、42例中度慢乙肝患者、38例重度慢乙肝患者以及30例健康对照人群外周血中TRECs的含量以及CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴细胞亚群表达。 结果 慢性乙型肝炎患者中轻、中、重组以及健康对照组间相比CD3+/CD4+/CD8+、CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+变化均无明显差异（P>0.05）；CD8+CD45RA+均有不同程度的下降，尤其在重度组中下降最为明显，具有统计学差异（P<0.05），CD8+CD45RO+存在明显的升高，同样在重度组中升高最为显著具有统计学差异（P<0.05）；TRECs含量慢乙肝组较正常对照组明显降低（P<0.05）；在慢性乙型肝炎患者中轻、中、重慢乙肝组间TRECs含量也存在统计学差异（P<0.05）。 结论 TRECS是胸腺近期输出功能指标，能够反映慢性乙型肝炎近期免疫功能，外周血TRECS与CD45+T淋巴细胞亚群联合检测较常规CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群更能全面了解慢性乙型肝炎的进展及预后。

[关键词] T细胞受体重排删除环；CD45；慢性乙型肝炎；实时荧光定量PCR；流式细胞技术

[中图分类号] R512.62 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）23-0008-04

Clinical significance of TRECs and CD45+T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with chronic hepatitis B

WANG Chen1 ZHANG Yongle2 PAN Kenv1 LV Tiefeng1

1.Department of Hepatology， Hangzhou XIXI Hospital， Hangzhou 310023， China； 2.Clinical Laboratory， Tongde Hospital of Zhejiang Province， Hangzhou 310012， China

[Abstract] Objective To investigate the content of T cell receptor rearrangement（TRECs） and the expression of CD4+CD45RA+， CD4+CD45RO+， CD8+CD45RA+， CD8+CD45RO+T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with chronic hepatitis B. Methods The content of TRECs and the expression of CD4+CD45RA+， CD4+CD45RO+， CD8+CD45RA+， CD8+CD45RO+T lymphocyte subsets in peripheral blood of 32 patients with mild chronic hepatitis B， 42 patients with moderate chronic hepatitis B， 38 patients with severe chronic hepatitis B and 30 healthy controls were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and flow cytometry. Results There was no significant difference in CD3+/CD4+/CD8+， CD4+CD45RA+， CD4+CD45RO+T lymphocyte subsets between mild， moderate， recombinant and healthy controls in patients with chronic hepatitis B（P>0.05）； CD8+CD45RA+T lymphocyte subsets decreased in all groups， especially in the severe group， and the difference was statistically significant（P<0.05）； CD8+CD45RO+T lymphocyte subsets were significantly increased in all groups， the most significant increase in the severe group was statistically significant（P<0.05）； Compared with the normal control group， the content of TRECs in the chronic hepatitis B group was significantly decreased（P<0.05）； There was also a significant difference in TRECs content between mild， moderate and severe hepatitis B groups（P<0.05）. Conclusion TRECs is a short-term output function of thymus， can respond to the recent immune function of chronic hepatitis B.Compared with conventional CD4+ and CD8+T lymphocyte subsets， TRECs and CD45+T lymphocyte subsets were able to fully understand the progression and prognosis of chronic hepatitis B.

[Key words] T cell receptor rearrangement； CD45； chronic hepatitis B； Real-time fluorescence quantitative PCR； Flow cytometry

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染肝细胞后，HBV不是直接杀伤肝细胞，而是诱导被感染者主动、被动免疫应答造成肝细胞损伤。T淋巴细胞亚群失衡、功能障碍是导致乙型肝炎慢性化的主要原因；胸腺是人体免疫特别是细胞免疫的重要器官，诱导T细胞分化和成熟，胸腺功能的表达在HBV感染慢性化的发生、发展及预后过程中具有重要的意义[1]。笔者采用实时荧光定量PCR技术和流式细胞技术对健康人群、不同程度（轻、中、重）的慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血PBMCs中TRECs的含量及外周血中CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴细胞亚群进行检测分析，探讨慢性乙型肝炎的病情进展与TRECs及CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴细胞亚群间的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象

收集2016年1～12月在杭州市西溪医院住院治疗的慢性乙型肝炎患者112例，诊断标准符合2015中国《慢性乙型肝炎防治指南》[2]，排除其他嗜肝病毒感染致肝损以及其他导致肝脏损伤的相关疾病。其中32例轻度慢乙肝患者、42例中度慢乙肝患者、38例重度慢乙肝患者，男65例，女47例，年龄分布为25～40岁，平均年龄31.9岁；2016年本院职工健康体检30例为对照组。各组年龄和性别分布无统计学差异，见表1。

1.2 仪器与试剂

流式细胞仪：美国Beckman Coulter公司CF 500流式细胞计数仪；高速冷冻离心机和连续可调移液器均为德国Eppendorf公司生产；实时荧光定量PCR仪为美国AB公司生产型号 Stepone Plus。试剂：美国Beckman Coulter公司生产的淋巴细胞分离试剂以及CD3+/CD4+/CD8+淋巴细胞和CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴细胞试剂；PCR测定所需Buffer液、DNTP、Taq酶等原料购自TaKaRa Biotec；引物、探针由上海生工生物技术有限公司合成，广州蓝博生物科技有限公司生产外周淋巴细胞分离液及核酸抽提试剂。

1.3 方法

采用流式细胞计数进行检测CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴细胞计数；采用实时荧光定量PCR技术进行TRECs含量检测。

1.3.1 流式细胞仪检测淋巴细胞计数 采用EDTA抗凝管抽取全血2 mL（每mL新鲜全血中加1.8 mg EDTA抗凝）。吸取CD3+PE/CD4+FTTC/CD8+PC5三色试剂10 μL，试剂批号为：SWP201602；吸取CD4+ FTTC/CD45RA+ PE/CD45RO+ PC5三色试剂10 μL，试剂批号为：SWP201605；吸取CD8+ FTTC/CD45RA+ PE/CD45RO+ PC5三色试剂10 μL，试剂批号为：SWP201604，分别置于三支洁净试管中，再分别加入50 μL全血，充分混匀，室温避光放置20 min。加入1 mL细胞裂解液，充分混匀，避光室温放置15 min，加入2 mL PBS液充分混匀，1000 rpm离心5 min，弃上清用吸纸吸干残留液体。向试管中加入0.5 mL PBS液混匀，进行流式细胞计数仪检测。使用CXP系统设定检测淋巴细胞数量>2000个，对预检测标本进行设门检测。

1.3.2 实时荧光定量PCR检测TRECs EDTA抗凝血1 mL，用PBS 1：1进行稀释后，轻轻转入1 mL的淋巴分离液中，水平冷冻离心机2500 rpm离心15 min，吸取中间层漂浮云雾状物置于1.5 mL离心管，12000 rpm离心10 min弃上清，在沉淀中加入50 μL DNA抽提液100℃，煮沸10 min，12000 rpm离心5 min取上清5 μL为模板进行下一步PCR检测。TRECs实时荧光定量PCR检测总反应体系为50 μL，其中上下游引物各0.5 μmol/L； dNTP各0.2 mmol/L；Taq酶1.5U；荧光探针0.1 μmol/L；Mg2+ 4 mmol/L；模板或标准品5 μL；加双蒸水补足50 μL；反應条件设置为94℃ 2 min；94℃ 30 sec；56℃ 45 sec运行40个循环，保存结果，自动分析。

1.4 统计学处理

采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，两组数据间的关系采用线性相关分析法，多组数据比较采取单因素方差分析法；计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 淋巴细胞亚群在慢性乙型肝炎轻度、中度、重度及健康对照组间比较

外周血CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+、CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+T细胞亚群百分比计数在慢性乙型肝炎轻度、中度、重度及健康对照组间比较无统计学差异（P均>0.05），CD8+CD45RA+T细胞百分比在健康对照组以及慢性乙型肝炎轻度、中度、重度组中呈现逐渐降低趋势，存在统计学差异（P<0.05）；CD8+CD45RO+T细胞百分比在健康对照组以及慢性乙型肝炎轻度、中度、重度组中呈现逐渐升高趋势，存在统计学差异（P<0.05）。见表2。

2.2 TRECs含量在慢性乙型肝炎輕度、中度、重度及健康对照组间比较

TRECs含量在慢性乙型肝炎轻度、中度、重度及健康对照组间含量分别为（5.82±1.87）logcopies/106 PBMCs、（5.11±1.42）logcopies/106 PBMCs、（4.05±1.15）logcopies/106 PBMCs、（6.42±2.02）logcopies/106 PBMCs；各组间比较存在统计学差异（P<0.05）。见表3。

3讨论

乙肝病毒（HBV）感染可导致患者呈现急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝硬化甚至肝癌的发生[3]。实验表明HBV感染的病情进展与患者特异性的T细胞反应强弱有着密切关系[4]。调节性T淋巴细胞是近年发现具有免疫抑制功能的T细胞亚群，它能够负向调节针对自身和外来抗原的免疫反应[5-6]。在调节性T淋巴细胞中又可分为原始幼稚性CD45RA+T淋巴细胞（原始T淋巴细胞）和记忆性CD45RO+T淋巴细胞。CD45RO+T细胞表现为记忆细胞的特性，具有辅助诱导作用；而CD45RA+T细胞却表现为初始的T细胞特点，具有抑制免疫的作用[7-8]。因此CD45RA+T淋巴细胞和CD45RO+T淋巴细胞常用来作为疾病活动、复发和疗效的判断，具有很重要的临床意义[9]。

本文对慢性乙型肝炎轻度、中度、重度以及健康对照者的外周血中CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴细胞表达进行研究，通过实验我们发现外周血CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+细胞亚群百分比计数在慢性乙型肝炎轻度、中度、重度及健康对照组间比较无统计学差异。慢性乙型肝炎轻度、中度、重度感染者与健康对照者相比CD8+CD45RA+T细胞明显减低，CD8+CD45RO+T淋巴细胞明显增高，而CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+T细胞无明显改变，这一结论提示，在慢性乙型肝炎感染中常规检测CD3+/CD4+/CD8+细胞亚群并不能反映疾病感染的状态，与俞立飞等[10]报告一致。而CD8+CD45RO+T淋巴细胞在乙型肝炎的慢性化过程中起到重要作用，与慢性乙型肝炎患者病情进展呈正相关[11]。这一现象可能与CD8+CD45RA+T原始幼稚淋巴细胞的持续存在，当乙肝病毒持续感染肝细胞时大量CD8+CD45RA+T原始幼稚淋巴细胞转换成为CD8+CD45 RO+T记忆性淋巴细胞，因此出现随着肝病程度的加重CD8+CD45RA+T百分比下降，而CD8+CD45RO+T百分比上升。CD8+CD45RO+T淋巴细胞的增多发挥其免疫诱导作用，进而致使机体杀伤感染HBV肝细胞，导致更多的肝细胞坏死，加重肝脏的严重程度。

在临床实践中获取胸腺组织了解胸腺功能变化并不现实。因此，胸腺功能的评估通常使用能够反映胸腺近期输出功能的间接指标[12]。TRECs是一种可稳定存在的游离基因，其不随T细胞分裂增殖而扩增，而是随着T细胞分裂增殖而逐渐稀释，所以测定TRECs含量可以了解初始T细胞的含量[13]。国内外学者研究表明外周血单个核细胞（PBMCs）中T细胞受体重排删除环（TRECs）含量能反映机体近期胸腺输出功能。如早在1998年，Douek等[14]首先报道使用TRECs来评价HIV-1感染者的胸腺功能；马旭明等[15]发现急性冠脉综合征患者Treg细胞中TREC的数量明显减少。患者CD31+ Treg比例的下调与Treg细胞中TRECs数量的减少呈正相关；李文言等[16]利用TRECs含量评价丙种球蛋白缺乏血症患儿的胸腺输出功能；李晓勇等[17]通过切除小鼠胸腺后检测TRECs含量证实胸腺切除后TRECs明显降低，这一现象不仅发生在幼鼠对成年小鼠的影响也极其大。

本文对慢性乙型肝炎轻度、中度、重度以及健康对照组的外周血进行TRECs含量的检测，结果分别为（5.82±1.87）logcopies/106 PBMCs、（5.11±1.42）logcopies/106PBMCs、（4.05±1.15）logcopies/106PBMCs、（6.42±2.02）logcopies/106PBMCs，健康对照组的TRECS含量明显高于慢性乙型肝炎患者（轻、中、重），在慢乙肝患者轻、中、重度组中也存在差异，随着肝炎程度的加重TRECs含量也明显降低，这一结论与国内外文献报道一致[18-20]，表明慢性乙型肝炎患者外周血T细胞数量减少与胸腺近期输出功能降低有关，并且肝脏炎症程度越重机体免疫输出功能越低。

综上所述，在慢性乙型肝炎感染患者中常规的CD3+/CD4+/CD8+细胞亚群百分比计数并不能评价患者的免疫状态，CD45 RA+/RO+T淋巴细胞亚群检测能反映出慢乙肝患者的原始幼稚淋巴细胞转换记忆性淋巴细胞的过程，尤其CD8+CD45RO+T对慢性乙肝肝炎起到重要作用与病情呈正相关；TRECs含量能反映出慢乙肝患者胸腺近期输出的功能，因此在慢性乙型肝炎感染患者进行CD8+CD45RO+T和TRECs检测能全面评估患者免疫状态。

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（收稿日期：2018-01-26）