戴 颖 陈薇敏 徐姝琪 陈建清 胡良凯 徐选福 梁立维

肠纤维化及狭窄是多种慢性肠病比较棘手的并发症，目前临床上最常见的是由克罗恩病继发的肠纤维化和肠狭窄。超过1/3的克罗恩病患者一生至少需要接受一次肠道手术，而70%纤维化狭窄表型的患者在疾病进展10年内需要行肠管部分切除，手术1年后70% ～ 90%的患者吻合口狭窄复发且超过50%的患者会形成新的狭窄的[1]。流行病学数据显示，炎症性肠病的患病率和病死率在全球各个地区均呈升高趋势，且患病年龄年轻化，但男、女患病率没有显著差异[2-3]。青蒿素是1972年我国科研人员首次从菊科植物黄花蒿中分离得到的抗疟疾的有效单体，其衍生物包括二氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯，均含有过氧桥结构，属于新型倍半萜内酯化合物。近年来的相关研究证实，青蒿素具有抗疟疾、抗肿瘤、免疫调节等多种重要药理作用[4]。青蒿素衍生物有抗肝纤维化、肺纤维化及阻止胶原在肝、肺组织中沉积的报道[5-6]，但几乎没有其对于肠道纤维化是否有作用的相关报道。本实验旨在探讨蒿甲醚对硫酸葡聚糖 (dextran sulfate sodium, DSS)诱导的小鼠结肠炎肠纤维化的作用及机制，为肠纤维化的治疗提供实验依据。

材料与方法

一、动物与药品

1. 实验动物

雄性C57BL/6小鼠44只，SPF级，6 ～ 8周龄，体重20 ～ 25 g(上海实验动物中心)。

2. 药品

蒿甲醚(上海西宝生物)、硫酸葡聚糖5000(上海西宝生物)、地塞米松注射液(马鞍山丰原制药)。

二、实验方法

1. 动物分组

将44只小鼠随机分为4组，其中正常对照组8只，另三组每组12只，分别为模型组、地塞米松组(治疗对照组)、蒿甲醚组。

2. 造模及治疗

正常对照组小鼠始终饮用一般蒸馏水，另三组用DSS与蒸馏水配成3%浓度让小鼠自由饮用5 d，然后饮用普通水7 d，以此作为一个周期，共持续4个周期。从第3个周期开始，每天分别用橄榄油、地塞米松、蒿甲醚给小鼠灌肠，至第4周期结束。期间观察记录小鼠的临床表现、大便性状、体重、粪隐血情况。根据Murano等[7]制定的标准行DAI评分。

3. 标本采集

4个周期实验结束后，采用心脏穿刺取血获得血清样本，整个结肠(从肛门至回盲瓣)即刻取样、记录长度、重量[8]；观察结肠大体形态损伤，并参考Butzner等[9]评分方法进行评分。常规石蜡包埋，连续切片，HE染色，参考王皓等[10]的评分方法进行组织学评分。进行Masson胶原三色染色，并通过图像分析，取任意3个视野的胶原面积比值，计算平均值，进行胶原面积比值比较。取病变最严重的2处结肠组织制成组织匀浆备用。

4. 实验仪器与试剂

Thermo Scientific HERA cell CO2细胞培养箱，Thermo Scientific Multiskan Spectrum酶标仪，小鼠CTGF Elisa试剂盒购自上海复申生物科技有限公司，小鼠pⅢ前胶原Elisa试剂盒购自上海复申生物科技有限公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司，逆转录(RT)试剂盒购自Takara公司，SYBR Premix Ex Taq购自Takara公司，Real time PCR仪(Roche Lightcycle 480)。

5. RT-PCR检测结肠组织转化生长因子1(transforming growth factor-beta1, TGF-β1)mRNA表达

取70 mg组织样本按Tfizol试剂说明书抽提反应总RNA。反转录步骤按照试剂盒说明书进行。将反转录合成的cDNA进行PCR反应。TGF-β1上游引物：CTCCCGTGGCTTCTAGTGC；下游引物：GCCTTAGTTTGGACAGGATCTG。PCR总反应体系为25 μL，包括SYBR Premix Ex Taq，15 μL ；PCR Forward Primer(10 μM)，0.5 μL；PCR Reverse Primer(10 μM)，0.5 μL；DNA模板，0.5 μL；dH2O(灭菌蒸馏水)，8.5 μL。用漩涡振荡器将管中溶液彻底混合均匀，短暂低速离心。点样后置于Realtime PCR仪上进行PCR反应：反应条件：95 ℃，5 min，40个PCR循环(95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s；79 ℃，20 s [收集荧光])。扩增反应结束后，为了建立PCR产物的熔解曲线。跑下述程序(95 ℃，2 min；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s；99 ℃，15 s，并从72 ℃缓慢加热到99 ℃ 8 min)。各样品的目的mRNA和内参(GAPDH)分别进行Realtime PCR反应。数据采用2-ΔΔCT法进行分析。

6. Elisa检测血清结缔组织生长因子(cornective tissue growth factor, CTGF)和Ⅲ型前胶原(procollagen type Ⅲ, PCⅢ)

①实验前将试剂盒及待测标本放置室温平衡30min；②将标准品50 μL依次加入孔中，并做好标记；③在待测样品孔中先加样品稀释液40 μL ，然后再加待测样品10 μL (样品最终稀释度为5倍)；④在标准品和样品孔中分别加入50 μL酶联亲和物，充分混匀；⑤37 ℃温育60 min后弃尽孔内液体，用稀释好的洗涤液反复冲洗5次并扣干孔内剩余液体；⑥每孔按照次序，分别加入显色液，并充分混匀，在室温下避光反应15 min；⑦反应后每孔加入终止液50 μL，充分混匀，终止反应；⑧用酶标仪在450 nm测定OD值。

三、统计方法

结 果

一、一般情况

实验4个周期后，空白对照组全部存活，地塞米松组与蒿甲醚组各存活7只，造模组存活6只。与对照组相比，模型组小鼠体重减轻、DAI评分升高，结肠长度缩短、结肠重量增加。蒿甲醚/地塞米松干预组小鼠体重、DAI评分、结肠长度、重量等参数均有改善。其中，体重在2组干预组之间对比，P< 0.05，干预组分别与模型组、空白对照组对比，P< 0.01；DAI评分在对照组、蒿甲醚/地塞米松干预组之间无统计学差异，3组分别与造模组对比，P< 0.01。见图1、图2。结肠长度在2组干预组之间对比，P< 0.05，干预组分别与模型组、空白对照组对比，P< 0.01；结肠重量、重量长度比在蒿甲醚/地塞米松干预组之间无统计学差异，干预组与对照组、造模组及对照组与造模组之间两两对比，P< 0.01。见图3、图4。

图1 各组小鼠体重(蒿甲醚组体重比地米组轻，P < 0.05，蒿甲醚组、地米组分别与对照组及造模组对比，P < 0.01)

图2 各种小鼠DAI评分(蒿甲醚/地塞米松干预组之间无统计学差异，2组分别与造模组对比，P < 0.01)

图3 各组小鼠结肠长度(蒿甲醚组与地米组之间对比，P < 0.05，蒿甲醚组、地米组分别与造模组、对照组对比，P < 0.01)

图4 各种小鼠结肠重量(结肠重量在蒿甲醚/地塞米松组之间无统计学差异，这两组与对照组、造模组及对照组与造模组之间两两对比，P < 0.01)

二、结肠病理及组织学表现

对照组结肠组织无明显变化，造模组与2组干预组小鼠结肠与周围组织有不同程度的粘连，3组小鼠结肠有不同程度的缩短，肉眼未见穿孔及瘘管形成，肠管有不同程度的狭窄伴有局部管壁僵硬。沿肠系膜根部纵向剪开肠管后见除正常对照组外其余3组均有不同程度的充血、水肿、糜烂、出血，造模组最严重，结肠黏膜皱襞结构紊乱，肠壁明显增厚，有部分肠管局部坏死、黏膜剥脱。大体评分2组干预组之间没有统计学差异，干预组分别对比空白对照组及造模组均有统计学差异(P< 0.01)。见图5。

图5 各组小鼠大体评分、组织学评分及胶原面积比比较[大体评分、组织学评分、Masson胶原染色下地米组与蒿甲醚组之间均没有统计学差异，而这两组分别对比空白对照组及造模组均有统计学差异(P < 0.01)]

光学显微镜下，造模组全层可见大量淋巴细胞浸润，固有层水肿，黏膜肌层、黏膜下层水肿、增厚，可见纤维结缔组织增生。2组干预组也可见淋巴细胞浸润，但程度较轻，水肿、增厚也较轻。正常对照组小鼠黏膜几乎没有损伤。组织学评分2组干预组之间没有统计学差异，干预组分别对比空白对照组及造模组均有统计学差异(P< 0.01)。见图5、图6。

Masson胶原染色下，模型组可见黏膜层、黏膜下层、黏膜肌层和肌层均有胶原纤维表达，以黏膜下层最为显著。2组干预组可见上述各层有少量胶原纤维表达，仍以黏膜下层最为显著，胶原面积比2组之间没有统计学差异。正常对照组见极少量胶原纤维表达。2组干预组胶原面积比分别对比空白对照组及造模组均有统计学差异(P< 0.01)。见图5、图7。

图6 各组小鼠结肠组织光学显微镜照片HE染色[A:正常对照组(100倍)；B:地塞米松组(100倍),C:蒿甲醚组(100倍),D:造模组(40倍);组织学评分地塞米松组与蒿甲醚组之间没有统计学差异，2组分别对比空白对照组及造模组均有统计学差异(P < 0.01)]

三、血清CTGF和PCⅢ表达

模型组小鼠血清CTGF表达高于空白对照组、蒿甲醚干预组和地塞米松干预组，模型组与其他三组对比，P均 < 0.01；对照组小鼠血清CTGF表达低于2组干预组，P均 < 0.01；2组干预组之间对比，蒿甲醚组表达高于地塞米松组，P< 0.05。模型组小鼠血清PCⅢ表达高于空白对照组、蒿甲醚干预组和地塞米松干预组，模型组与其他三组对比，P均 < 0.01；对照组小鼠血清PCⅢ表达低于2组干预组，P均 < 0.01；2组干预组之间对比，蒿甲醚组表达高于地塞米松组，P< 0.05。见图8。

图7 各组小鼠结肠组织Masson胶原染色照片[A:正常对照组(40倍),B:地塞米松组(100倍),C:蒿甲醚组(100倍),D:造模组(100倍);胶原面积比地塞米松组与蒿甲醚组之间没有统计学差异;这两组胶原面积比分别对比空白对照组及造模组均有统计学差异(P < 0.01)。正常对照组见极少量胶原纤维表达]

图8 各组小鼠CTGF、PCⅢ表达比较(CTGF及PCⅢ在模型组表达均高于其他三组，P均 < 0.01；在空白对照组表达均低于地米组及蒿甲醚组，P均 < 0.01；在蒿甲醚组表达高于地米组，P < 0.05)

4. 结肠组织TGF-β1表达

模型组小鼠TGF-β1表达高于空白对照组、蒿甲醚干预组和地塞米松干预组，模型组与其他三组对比P均 < 0.01；对照组小鼠TGF-β1表达低于2组干预组，P均 < 0.01；2组干预组之间对比，蒿甲醚组表达高于地塞米松组，P值 < 0.05。见图9。

讨 论

肠纤维化被认为是对于慢性炎症和损伤活动过度的、不可逆的伤口愈合反应。肠纤维化、肠狭窄是炎症性肠病常见的并发症[11-12]。现有的治疗药物只能减轻CD肠道炎症，而对肠纤维化无效[13]。

图9 各组小鼠TGF-β1表达比较(TGF-β1在模型组表达高于其他三组，P均 < 0.01；在空白对照组表达均低于地米组及蒿甲醚组，P均 < 0.01；在蒿甲醚组表达高于地米组，P < 0.05)

青蒿素及其衍生物是我国科学工作者发掘祖国医药学宝库研究开发的一类新药，有快速、安全、高效、无耐药性等优点。随着对其药理的深入探索和临床研究的开展，目前已有文献提示该药有体外抗纤维化作用，动物实验证实其有抑制瘢痕增生、抗肺纤维化、抗肝纤维化等作用[5-6,14]。本研究应用DSS制备小鼠结肠炎纤维化模型，并用蒿甲醚进行干预，用地塞米松作为干预对照，发现使用蒿甲醚后能改善DSS所致的小鼠结肠炎的临床表现、结肠组织损伤及胶原面积比，同时可以降低CTGF、PCⅢ、TGF-β1表达，提示蒿甲醚对结肠炎肠纤维化有抑制作用。

肠纤维化是肠道慢性炎症的结果，表现为过度的、异常的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)沉积，异常的ECM收缩形成瘢痕、组织变形，引起肠道梗阻。胶原蛋白是ECM中含量最丰富的结构蛋白，与纤维连接蛋白(fibronectin)等构成ECM主要组成成分。在纤维化肠组织中发现自CD狭窄肠段分离、培养的成纤维细胞(fibroblasts, FB)等合成Ⅲ型胶原的能力显著增加。在本研究中，模型组、对照组与干预组的PCⅢ水平差异有统计学意义(P< 0.01)，提示各组小鼠的纤维化程度存在统计学差异。

转化生长因子-β(TGF-β)是多数组织纤维化的关键细胞因子[15]，其与纤维化发生发展、ECM的合成有着密切的联系。有研究[16]表明，TGF-β过度表达会促进ECM大量累积，而抑制其降解，是IBD肠纤维化的重要致病原因。TGF-β也能够促进成纤维细胞自身合成TGF-β，成纤维细胞的这种自分泌作用也是导致纤维化进展的重要原因之一[17]。但TGF-β是一种多效细胞因子，除了在肠纤维化过程中有双重作用外，还有许多其他作用，如调节免疫、抗肿瘤等，故这不是一个理想的治疗靶点，作为TGF-β下游效应分子的CTGF纳入了我们的视线。

结缔组织生长因子(CTGF)是1991年BRADHAM等首先在人脐静脉内皮细胞的条件培养基中发现的[18]，它是一种由349个氨基酸组成，分子量为34 ～ 38KD的富含半胱氨酸的分泌肽，能调节纤维化、凋亡、血管发生、细胞迁移、肿瘤增殖和转移的大分子，与纤维化疾病密切相关，常介导TGF-β的促纤维化作用[19]。CTGF主要由TGF-β诱导表达，临床和实验研究均已证实CTGF的表达与纤维化程度积分呈显著正相关，作为TGF-β的特异性下游分子，TGF-β对CTGF基因转录有明显的调控作用，研究表明，在多种组织器官纤维化疾病 (如结缔组织纤维化、病理性瘢痕形成及器官纤维化等)中，TGF-β与CTGF大多协同表达增加，在缺少CTGF时，TGF-β不能单独促进组织纤维化进程。CTGF在正常组织中无表达或极低表达[20]，在纤维化狭窄肠段FB中的CTGF蛋白和mRNA明显过度表达，与正常对照组比较，表达是正常组5倍以上[21]。Vozenin-Brotons等[22]的研究提示在放射性肠纤维化中，CTGF也有高水平表达。这些说明CTGF与纤维化存在正相关，以FB为主的间质细胞CTGF在狭窄肠段的持续高表达成为肠纤维化形成的基础。

本研究发现结肠炎造模组的TGF-β1、CTGF的表达均明显增高，蒿甲醚干预后，二者的表达水平明显下降，提示蒿甲醚具有明显抑制DSS诱导的小鼠结肠炎肠纤维化的作用，该作用结果可能是通过下调TGF-β1、CTGF发生。