施柳辉，施飞，戴军，何竑超#，何威，徐丹枫

1民航上海医院泌尿外科，上海200336

2上海交通大学医学院附属瑞金医院泌尿外科，上海200025

肾癌骨转移是影响肾癌患者临床预后的重要因素。流行病学调查显示，近年来肾癌骨转移的发生率呈持续性上升的趋势[1]。临床上发生肾癌骨转移能够导致患者病死率上升，5年生存率显著下降，致残风险升高[2]。肿瘤相关因子的改变能够影响肿瘤细胞对骨质细胞的黏附能力，增加发生骨转移的风险。促分裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）和胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）能够改变肿瘤细胞对血管内皮或淋巴结的黏附能力，进而促进肿瘤细胞的转移[3-4]。近年来已有研究证实，MEK和ERK蛋白在卵巢癌、甲状腺癌、肝癌、肾癌等恶性肿瘤的发生过程中发挥了重要的作用，MEK和ERK蛋白的高表达是导致患者临床分期晚、肿瘤细胞分化程度下降、术后复发风险升高的重要因素[5-6]，但目前尚缺乏MEK和ERK蛋白表达与肾癌骨转移关系的研究。本研究回顾性分析80例原发性肾癌患者的临床资料，探讨MEK和ERK蛋白表达与肾癌骨转移的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2015年1月至2017年6月于民航上海医院治疗的原发性肾癌患者的临床资料。纳入标准：①均经病理组织学确诊为原发性肾癌；②术前未行靶向治疗、放疗、化疗或免疫治疗。排除标准：临床或病理资料不完整者。根据纳入和排除标准，本研究共纳入80例原发性肾癌患者。80例患者中，男46例，女34例；年龄38～67岁，中位年龄51岁；病理类型：透明细胞癌64例，乳头状细胞癌9例，嫌色细胞癌7例；有骨转移12例，无骨转移68例。收集患者的肾癌原发灶组织、癌旁组织（距肿瘤边缘＞5 cm）、骨转移灶组织标本。

1.2 免疫组织化学染色

石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温避光放置10 min，加入10 mmol/L pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液2 ml进行抗原修复，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗5 min，滴加正常山羊或兔血清封闭处理，37℃，15 min。用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加一抗，37℃，2 h；滴加生物素化二抗，37℃，40 min；PBS冲洗5 min，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，加拿大树胶（或中性树胶）封片。

1.3 结果判断

MEK和ERK蛋白表达于细胞质或细胞核中，阳性表现为细胞内出现棕黄色颗粒。采用双评分半定量法进行评分[6]，依据阳性细胞比例评分：阳性细胞比例＜5%为1分，5%～50%为2分，≥51%为3分；依据染色强度评分：未着色为1分，淡黄色为2分，黄色为3分，棕黄色为4分。最终得分为阳性细胞比例和染色强度评分之积，≤4分为阴性表达，＞4分为阳性表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；相关性分析采用Spearman秩相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中MEK和ERK蛋白阳性表达率的比较

有骨转移的肾癌原发灶和无骨转移的肾癌原发灶中MEK和ERK蛋白的阳性表达率均高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）；有骨转移的肾癌原发灶和无骨转移的肾癌原发灶中MEK和ERK蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。骨转移灶中MEK和ERK蛋白的阳性表达率均高于无骨转移的肾癌原发灶和有骨转移的肾癌原发灶，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表 1）

表1 不同肾组织中MEK和ERK蛋白阳性表达情况的比较[ n（%）]

2.2 不同病理类型肾癌原发灶中MEK和ERK蛋白阳性表达率的比较

透明细胞癌、乳头状细胞癌和嫌色细胞癌原发灶中MEK和ERK蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 不同病理类型肾癌原发灶中MEK和ERK蛋白的阳性表达情况[ n（%）]

2.3 MEK和ERK蛋白表达的相关性分析

骨转移灶中MEK和ERK蛋白表达无相关性（P＞0.05），无骨转移的肾癌原发灶中MEK和ERK蛋白表达呈正相关（rs=0.707，P＜0.05），有骨转移的肾癌原发灶中MEK和ERK蛋白表达也呈正相关（rs=0.897，P＜0.05）。（表3～表5）

表3 骨转移灶中MEK和ERK蛋白表达的相关性

表4 无骨转移的肾癌原发灶中MEK和ERK蛋白表达的相关性

表5 有骨转移的肾癌原发灶中MEK和ERK蛋白表达的相关性

3 讨论

肾癌发生骨转移的机制较为复杂，但一般认为与自身遗传易感性、骨质局部解剖结构或者分子生物学改变等有关。特别是在病程较长、临床分期较晚的肾癌患者中，骨转移的发生风险明显升高[7]。现阶段临床上主要通过影像学检查评估骨转移的风险，但单纯磁共振检查或者X线检查评估骨转移的价值较为局限。ERK蛋白相关血清学指标在评估恶性肿瘤的转移风险中具有重要的指导价值，具有检查方便、费用较低等优势。通过对肾癌骨转移相关分子机制的研究，能够为临床上肾癌骨转移的免疫靶向治疗提供新的参考靶点。

MEK和ERK蛋白是重要的肿瘤相关蛋白，其上游启动子转录活性的增加能够提高ERK蛋白的翻译活性，使肿瘤细胞的生物学特征明显改变[8]。ERK蛋白上调能够通过影响肿瘤细胞的浸润能力而增加肿瘤细胞的扩散或转移风险。基础方面的研究表明，ERK蛋白翻译增加是导致骨干骺端骨质细胞密度改变、局部干骺端新生血管通透性改变、血流缓慢的重要因素，而相关病理过程的发生均可以增加肾癌细胞发生骨转移的风险[5]。另外，MEK/ERK信号通路的激活能够诱导趋化因子的富集，特别是CXCL4、CXCL3等的上调能够诱导肾癌细胞黏附分子表达水平的变化，增加肿瘤细胞黏附骨质细胞、骨小梁的可能[9-10]。有研究认为，MEK和ERK蛋白高表达是促进肾癌患者临床分期进展的重要因素[10]，但关于肾癌原发病灶及骨转移病灶中MEK和ERK蛋白的分析研究不足。

本研究结果显示，有骨转移的肾癌原发灶和无骨转移的肾癌原发灶中MEK和ERK蛋白的阳性表达率均高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示MEK和ERK蛋白均可能参与了肾癌的发生过程，考虑可能的原因如下[11-12]：①MEK蛋白高表达能够促进肿瘤细胞DNA的扩增，导致肿瘤细胞突破基底膜的风险增加；②ERK蛋白高表达能够导致肾癌上皮细胞的异型性改变，增加肿瘤细胞的核分裂象。本研究结果表明，在不同病理类型的肾癌组织中，MEK和ERK蛋白的表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），提示MEK和ERK蛋白表达的差异并不会影响肿瘤细胞的病理类型，这可能是因为肿瘤细胞的病理类型主要与肿瘤细胞分化过程中诱导分子的调控作用有关。秦彩朋等[13]研究表明，肾癌原发灶中MEK和ERK蛋白的表达水平均低于骨转移灶（P＜0.05）。本研究结果表明，骨转移灶中MEK和ERK蛋白的阳性表达率均高于无骨转移的肾癌原发灶和有骨转移的肾癌原发灶（P＜0.05），提示MEK和ERK蛋白的表达水平与骨转移过程有关。MEK和ERK蛋白对于骨转移发生的影响，主要由于二者可以增加骨小梁局部血管内皮的通透性，从而导致肿瘤细胞突破血管内皮，使其黏附骨小梁的可能性增大，同时ERK蛋白还可诱导骨源性趋化因子的生成，启动肿瘤细胞的特异性黏附过程[14]。本研究的相关性分析结果显示，在无骨转移的肾癌原发灶和有骨转移的肾癌原发灶中MEK和ERK蛋白表达均呈正相关（P＜0.05），提示在肾癌发病的早期，MEK和ERK蛋白发挥了重要的协同刺激作用；而在骨转移灶中，MEK和ERK蛋白表达无相关性。

综上所述，肾癌骨转移灶中MEK和ERK蛋白的阳性表达率均高于原发灶，MEK和ERK蛋白可能参与了肾癌骨转移过程，值得进一步研究。