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轮状病毒(Rotavirus,RV)是引起儿童发生严重腹泻甚至死亡的重要病原[1]，它还能够感染牛、猪、马、羊、兔、禽、猫类等动物并引起病毒性腹泻。在我国，王成东等于2009年首次从大熊猫腹泻粪便中检测出轮状病毒，将其命名为大熊猫轮状病毒(Giant Panda Rotavirus,GPRV)CH-1毒株。迄今为止，在人类、哺乳动物和鸟类分离的RV根据病毒外壳特异性抗原可将RV分为A～I 9个不同的组，其中A、B、C和H组可感染人和动物，而D、E、F、G和I组只感染动物[2-4]。RV包括P和G两种血清型，其中G1-G4、G9、P[8]和P[4]是最常见的流行优势株，在全球主要流行的RV基因型G1P[8]，G2P[4]，G3P[8]和G12P[8][5]。GPRV CH-1株的血清型为G1-P[7]-I5- R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1[6]。

GPRV CH-1株主要感染5-11月龄的断奶大熊猫，感染后通常表现为体温升高、呕吐、水泻、蛋花样腹泻，腹泻物中含有血，白细胞总数和中性粒细胞增多，淋巴细胞减少、腹水、顽固性胃肠胀气、腹泻迁延不愈甚至死亡等症状[7-8]，通过常规对症治疗能较大缩短该病的治疗疗程、治愈率达100 %，且很少出现并发症[8]，但目前尚无有效疫苗和特效药物对GPRV感染进行防治，这对大熊猫的健康造成了严重威胁。

1 GPRV基因结构及进化特点

GPRV CH-1株属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，病毒粒子呈球形似车轮状，直径70 nm[7]。GPRV CH-1株基因组为线状双股RNA，它包含11个基因片段(1-11)，这些基因分别编码6个结构蛋白(VP1-VP4，VP6，VP7)和5个非结构蛋白(NSP1-NSP5)，长度分别为3 287 bp，2 717 bp，2 591 bp，2 362 bp，1 356 bp，1 042 bp，1 532 bp，1 042 bp，1 017 bp，750 bp，663 bp。其中VP4、VP6、VP7是GPRV的主要抗原性基因[9-16]。每个基因片段分别包含一个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)[6]，长度分别为3 267 bp，2 673 bp，2 508 bp，2 362 bp，1 194 bp，981 bp，1 461 bp，954 bp，942 bp，528 bp和594 bp另外，GPRV CH-1株的VP1，VP3，VP4，VP6，VP7和NSP4基因主要与人或猪RV的基因的进化距离最近，其同源性见表1[10-15]。

表1 GPRV CH-1株基因序列与人和猪RV的同源性Tab.1 Homologies for the rotavirus genes from giant panda,human and porcine

2 病毒蛋白

蛋白质是病毒粒子的主要成分，具有重要的功能。GPRV CH-1株有11种蛋白成分，包括6个结构蛋白与5个非结构蛋白。编码结构蛋白(VP1-VP4，VP6，VP7)的氨基酸长度分别为1 088，890，835，776，397，326 aa以及编码非结构蛋白(NSP1-NSP5)的氨基酸长度分别为486，317，313，175和197 aa[6]。对这些蛋白的信号肽、跨膜区、疏水性、抗原表位、N-糖基化作用位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化作用位点和N-豆蔻酰化位点等结构进行分析，其中N-糖基化作用位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化作用位点和N-豆蔻酰化位点分别与抗原性和免疫原性[17]，介导胞外分泌[18]，病毒凋亡和病毒周期的调节[19]和蛋白定位于内质网或线粒体外膜[20]这些生物学功能有关，但对VP2蛋白的生物信息学特点暂无相关文献报道。表2是GPRV CH-1株(VP2除外)结构蛋白的生物信息学特点。

表2 GPRV CH-1株结构蛋白的生物信息学特点Tab.2 Bioinformatics characteristics of structural proteins of GPRV strain CH-1

注：通过ProtScale分析的蛋白质疏水性，为蛋白质的最小疏水性与最大疏水性，正值表明疏水，负值表明亲水。

3 实验室诊断

采取发病大熊猫的呕吐物、腹泻便、肛拭子、血液等样本进行抗原检测，包括轮状病毒粪便抗原ELISA诊断试剂盒和病毒分离鉴定等[7]。另外，通过提取样本中的RNA，进行分子生物学检测，包括RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)扩增[21]和实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)[22]等方法。

3.1抗原检测 王成东等[7]用兰州生物制品研究所生产的RV粪便抗原ELISA诊断试剂盒检测腹泻物出现RV阳性结果；同时将处理过的标本接种于MA-104细胞进行病毒分离培养，出现病变以后，用检测抗原或核酸方法鉴定病毒。通过电镜形态观察、理化特性、中和实验等方法，鉴定分离到的病毒颗粒为RV。

3.2分子诊断 GPRV CH-1株在大熊猫粪便中含量较高，可通过提取大熊猫粪便的总RNA进行分子生物学诊断，即常规RT-PCR和qRT-PCR。根据GPRV CH-1株保守基因VP7序列设计引物，对从大熊猫粪便中提取到的RNA和实验室保存病毒液的RNA同时进行反转录，将得到的cDNA进行PCR扩增，RT-PCR扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并测序，最低可以检测出大约1pg的病毒RNA，该诊断结果重复性较好，可用于GPRV CH-1株的临床快速诊断[21]。此外，根据GPRV CH-1株VP4基因序列设计引物[22]，进行qRT-PCR扩增，最低可检测到的拷贝数为1.0×100拷贝/μL，与常规RT-PCR相比，其灵敏度至少高出100倍，两种方法的特异性与重复性均较好[21-22]。

通过上述两种方法[23]对2011至2015年(除2014年)大熊猫基地A和B共227份大熊猫粪便中的GPRV CH-1株进行检测，利用qRT-PCR方法检测出25份阳性粪便样品，阳性率为11%(25/227)，而利用常规RT-PCR只检出15份阳性粪便样品，阳性率为6.6%(15/227)，表明qRT-PCR更适用于GPRV CH-1株的诊断检测。因此，一旦发现有腹泻等症状，应及时采取qRT-PCR方法对大熊猫的粪便进行快速且精确的检测，以预防更严重的传染。目前对于RNA病毒的检测，RT-LAMP(loop-mediated isothermal amplification)是快速且灵敏的方法，该方法简便易操作不需要高端仪器，直接通过肉眼观察结果，可快速检测病原[24-26]，但目前仍然没有用于检测GPRV CH-1株。

4 防治措施

RV主要是通过水源传播或呼吸道传播，因此，预防RV感染的主要措施是关注大熊猫的饮食方面的健康。同时，RV是人兽共患病毒，保证大熊猫与其接触人员的安全距离也极其重要。另外，饲养员应定期收集大熊猫粪便，定期检测GPRV CH-1株感染情况。一旦诊断发现为GPRV CH-1株感染，及时采取隔离办法并治疗感染大熊猫。对于GPRV CH-1株感染主要可通过对症治疗和常规抗感染治疗，这能缩短该病的治疗疗程且治愈率高达100%，主要包括：抗生素治疗；及时纠正水、电介质和酸碱平衡紊乱；及时调整人工配乳的浓度和饲喂量；使用消化酶、肠黏膜保护剂以及使用微生态制剂进行肠道菌群调整，而且被治愈的大熊猫很少出现并发症[8]。

目前尚无有效疫苗预防GPRV CH-1株感染和特异性治疗药物，但马磊将GPRV CH-1株的VP4和VP7基因与真核表达载体pVAX1进行定向连接，构建出真核表达质粒，再将其转化入减毒鼠伤寒沙口氏菌，这为研究以减毒沙门氏菌为载体的GPRV CH-1株疫苗的生物学性质奠定了基础[27]，同时为预防大熊猫感染GPRV起着重要作用。

5 展 望

大熊猫是我国珍稀动物，其繁殖率与生存率也较低，而 GPRV CH-1株主要感染幼龄大熊猫，引起大熊猫腹泻甚至死亡，在2000-2003年，成都大熊猫繁育研究基地的RV发病率为 64.7%。由于成年动物感染轮状病毒多为隐性经过，并持久地向外界排毒，加之轮状病毒对环境因子和许多常见消毒剂有较强抵抗力，导致某一地方发病，随后的每年会连续发生[8]。但是通过常规对症治疗后治愈率达100%，现目前对 GPRV CH-1株的相关研究主要在于其感染来源、诊断方法、防治措施和GPRV CH-1株的分子特点，病毒感染发病机制及机体免疫应答机制的相关研究缺乏，造成了对 GPRV CH-1株认识的不足。另外，由于病毒的侵入会引起宿主细胞的蛋白表达模式改变，将影响宿主细胞的正常生理功能并决定病毒的致病进程和结果[28-30]，因此通过研究病毒感染宿主细胞后引起的细胞因子转录水平及蛋白质水平的变化，将有利于揭示病毒与宿主或宿主细胞的相互作用机制和病毒分子致病机制。

根据中国GPRV的研究现状，应加强以下几方面的研究：加强GPRV流行病学调查，分离新毒株并进行基因组学与蛋白组学研究，了解GPRV不同分离株基因型分布情况；进行GPRV感染其宿主细胞后的转录组及蛋白质组水平分析GPRV感染复制机制、致病机制及机体免疫应答机制的相关研究；加强病原诊断与疫苗以及抗病毒药物的研发等。