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猪囊尾蚴病(cysticercosis cellulosae)是由猪带绦虫(Taeniasolium,Ts)的中绦期幼虫-猪囊尾蚴寄生于人或猪的一种严重危害养猪业和人类健康的人兽共患寄生虫病，在上个世纪，我国是猪囊尾蚴病高发国家之一[1-2]。随着社会进步，消费者对该病的认识不断加深，该病在科技工作者的不断努力之下，发病率急剧下降。猪囊尾蚴可寄生于人体皮下、肌肉、眼、脑、心脏等部位，其中以脑囊虫病危害最为严重，具有较高的致残率和致死率[3-5]。药物及手术治疗都有其局限性，疫苗防治该病已成为当前研究热点[6]，并发现了许多免疫原候选基因，如45W、TSOL16、TSOL18等，其中TSOL18基因是猪带绦虫六钩蚴阶段重要的免疫原基因，具有良好的免疫原性和免疫保护性，被认为是最具前景的疫苗候选基因之一[7]。

乳酸乳球菌(Lactococcuslactis,L.lactis)是一种公认的食品级微生物，广范应用于食品、医药等相关领域[8-9]。随着基因工程技术的发展，选择具有高效、无毒副作用的L.lactis作为载体已构建了一系列基因工程重组菌[10-14]。本研究拟将猪带绦虫重组质粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18电穿孔转化入L.lactisMG1363，分别在无红霉素抗性和含红霉素抗性条件下连续人工传代20次，通过测定质粒稳定率和SacI/HindIII双酶切鉴定，测定质粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18在L.lactis中的遗传稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1质粒与菌种 重组质粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18、由本实验室保存；L.lactisMG1363购于南京钟鼎生物技术有限公司。

1.1.2主要试剂和仪器 GM17培养基购于美国OXOID公司，DNA Marker、质粒抽提试剂盒购于上海生工生物工程有限公司；红霉素购自sigma公司；其他试剂均为国产分析纯；核酸电泳仪购于北京六一生物科技有限公司；PCR仪购自美国MJ Research公司。

1.2 方法

1.2.1重组质粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18电转化L.lactisMG1363 以GenBank中登录的猪带绦虫TSOL18基因序列为模板(登录号为AF017788)，以乳酸菌为宿主系统进行基因优化，采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计引物，在其两端分别加入酶切位点SacI/HindIII以及保护性碱基，在其N端添加SPUSP45分泌信号肽序列，分别合成TSOL18和SP-TSOL18目的基因。将TSOL18和SP-TSOL18目的基因克隆至大肠杆菌-乳球菌穿梭表达质粒pMG36e，构建胞内型重组质粒pMG36e-TSOL18和分泌型重组质粒pMG36e-SP-TSOL18。分别将获得的pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18质粒与感受态L.lactisMG1363混合，冰浴10 min，电击。电转参数如下：电压200 V，电容25 F，电阻200 Ω，进行第一次脉冲，然后立即加入900 L低温的GMMC恢复培养基(M17培养基+0.5%葡萄糖+20 mmol/L MgCl2+2 mmol/L CaCl2)，冰上放置10 min，期间不要振动，30 ℃复苏培养2～3 h，将菌液4 000 r/min离心弃去上清后浓缩于100 μL GMMC中，将其涂布在10 μg/mL的红霉素GM17平板上，30 ℃培养2～3 d。期间保持相对密闭环境，观察菌落生长情况，1周左右，陆续形成细小的圆形白色不透明菌落。

选取不同的阳性菌落，分别在每个阳性菌落上使用灭菌牙签挑取2～3个单菌落，置于1 mL的G/L-SGM17+ 5 μg/mL红霉素液体培养基中，30 ℃静置培养72 h，待溶液出现明显的浑浊后待用。

1.2.2阳性克隆鉴定 取上述培养的菌液，10 000 r/min离心10 min，弃上清，ddH2O洗涤3次，10 000 r/min离心弃上清；加入30 μL的ddH2O，重悬后沸水浴10 min；冰浴2 min，10 000 r/min离心10 min，吸取上清，提取基因组DNA，作为PCR模板待用。使用基因特异性引物进行PCR鉴定，确认阳性克隆后作为表达菌株备用。

1.2.3重组质粒转化菌的传代培养 挑取上述鉴定为阳性克隆子的单菌落，分别接种于GM17+(含红霉素)液体培养基和GM17(不含红霉素)液体培养基中，30 ℃培养24 h后，4 ℃放置过夜并保种，分别取培养物进行划线接种于GM17平板，30 ℃培养24 h后，在划线平板上分别挑取100个单菌落接种于相应含红霉素的培养基与不含红霉素的培养基中，30 ℃培养24 h后计数生长菌落，重复以上操作传至20代，则停止传代。

1.2.4遗传稳定率测定和双酶切鉴定 重组质粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18转化菌分别在含红霉素抗性和不含红霉素的GM17培养基中，30 ℃培养，连续培养20代，每传5代进行一次遗传稳定率测定[15-16]，计算其质粒的遗传稳定性。质粒稳定率=100个单菌落接种于红霉素平板的菌落生长数。将各代次的重组质粒经限制性内切酶SacI/Hind III双酶切，酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2 结 果

2.1阳性克隆鉴定 取L.lactisMG1363、含pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18的培养菌液，吸取上清，提取基因组DNA为模板，使用基因特异性引物进行PCR鉴定，结果显示，1-6泳道为重组质粒pMG36e-TSOL18转化L.lactisMG1363阳性菌的PCR产物，见图1；1-6泳道为重组质粒pMG36e-SP-TSOL18转化L.lactisMG1363阳性菌的PCR产物，见图2。均与预期结果相符。

M:DNA Marker;1-6:PCR production of recombinant plasmid pMG36e-TSOL18 transformation bacteria;7:PCR production of L.lactis MG1363 negative bacteria图1 重组质粒pMG36e-TSOL18转化菌的PCR鉴定Fig.1 PCR identification of transformed bacteria of recombinant plasmid pMG36e-TSOL18

M:DNA Marker;1-6:PCR production of recombinant plasmid pMG36e-SP-TSOL18 transformation bacteria;7:PCR production of L.lactis MG1363 negative bacteria图2 重组质粒pMG36e-SP-TSOL18转化菌的PCR鉴定Fig.2 PCR identification of transformed bacteria of recombinant pMG36e-SP-TSOL18

2.2遗传稳定率测定 PCR鉴定阳性的重组质粒pMG36e-TOSL18和pMG36e-SP-TOSL18在L.lactisMG1363中连续传代20代时，在不含红霉素抗性条件下，质粒稳定率均为100%，在含有红霉素抗性条件下，质粒稳定率均为99%。见表1-4。

表1 L.lactis MG1363中pMG36e-TOSL18质粒在无红霉素选择压力下的遗传稳定率Tab.1 The genetic stable rate of pMG36e-TOSL18 plasmid in L.lactis MG1363 in the absence of erythromycin selective pressure

表2 L.lactis MG1363中pMG36e-TOSL18质粒在含红霉素选择压力下的遗传稳定率Tab.2 The genetic stable rate of pMG36e-TOSL18 plasmid in L.lactis MG1363 under the erythromycin selection pressure

表3 L.lactis MG1363中pMG36e-SP-TOSL18质粒在无红霉素选择压力下的遗传稳定率Tab.3 The genetic stable rate of pMG36e-SP-TOSL18 plasmid in L.lactis MG1363 in the absence of erythromycin selective pressure

表4 L.lactis MG1363中pMG36e-SP-TOSL18质粒在含红霉素选择压力下的遗传稳定率Tab.4 The genetic stable rate of pMG36e-SP-TOSL18 plasmid in L.lactis MG1363 under the erythromycin selection pressure

2.3双酶切鉴定 将各代次的重组质粒经限制性内切酶SacI/HindIII双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示大小正确，连续传至20代时，均有较好的遗传稳定性，与原代质粒相符。见图3、4。

M:DNA 标记物;1:转化pMG36e-TSOL18/L.lactis原代质粒;2:转化pMG36e-TSOL18/L.lactis原代质粒酶切后;3:转化pMG36e-TSOL18/L.lactis 5代质粒;4:转化pMG36e-TSOL18/L.lactis 5代质粒酶切后;5:转化pMG36e-TSOL18/L.lactis 10代质粒;6:转化pMG36e-TSOL18/L.lactis 10代质粒酶切后;7:转化pMG36e-TSOL18/L.lactis 15代质粒;8:转化pMG36e-TSOL18/L.lactis 15代质粒酶切后;9:转化pMG36e-TSOL18/L.lactis 20代质粒;10:转化pMG36e-TSOL18/L.lactis 20代质粒酶切后 图3 质粒 pMG36e-TSOL18人工传代后的酶切鉴定Fig.3 Identification of enzyme digestion of the recombinant plasmid pMG36e-TSOL18 after artificial passage

M:DNA标记物;1:转化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis原代质粒;2:转化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis原代质粒酶切后;3:转化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 5代质粒;4:转化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 5代质粒酶切后;5:转化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 10代质粒;6:转化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 10代质粒酶切后;7:转化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 15代质粒;8:转化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 15代质粒酶切后;9:转化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 20代质粒;10:转化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 20代质粒酶切后图4 质粒pMG36e-SP-TSOL18人工传代后的酶切鉴定Fig.4 Identification of enzyme digestion of the recombinant plasmid pMG36e-SP-TSOL18 after artificial passage

3 讨 论

基因工程重组乳球菌疫苗具有许多优点：1)它是食品和医药工业重要的食品级微生物，易培养，基因操作简便可靠，转化效率高，重复性好；2)L.lactis是一种革兰阳性菌，不分泌内毒素，表达的外源蛋白不需纯化(可简化生产工艺，降低生产成本)，可连同菌体直接服用(具有很好的安全性)；3)L.lactis通常不产生细胞外蛋白酶，不会在细胞外对分泌的外源蛋白进行降解；4)L.lactis通常较少分泌自身蛋白，减少了载体自身蛋白对分泌的外源蛋白的干扰；5)外源蛋白既可在细胞内表达，也可在细胞壁进行表达，还可以分泌到细胞外进行表达；6)L.lactis不在胃肠道定植，很少产生免疫耐受；7)口服接种方便，可诱导宿主产生较强的黏膜免疫应答和系统免疫应答[17-18]。因此，针对猪带绦虫卵经口感染的特点，选择L.lactis为载体，制备一种猪带绦虫重组乳球菌口服疫苗，可能是预防和控制猪囊尾蚴病较为安全、有效的实用新型疫苗。而疫苗制备的关键问题在于菌株的稳定性[19]。质粒的遗传稳定性是指转化细胞在生长期间能够保持一定的稳定性，含有的质粒不发生变化，并且能够在其生长过程中保留其原始的表型特征，对菌株遗传稳定性及后续的大规模生产等都有一定的应用价值[15,20-21]。

六钩蚴阶段是囊尾蚴感染的最早也是最重要的阶段，此阶段的抗原分子可能对虫卵感染具有更好的抵抗力，其中，TSO45W、TSOL16、TSOL18是应用于囊虫病疫苗研究的主要抗原分子。研究发现，TSO45W家族包含诸多抗原组份，本课题组验证以TSO45W-4B为抗原基因构建的重组Bb疫苗的保护率不太令人满意[22-25]；TSOL16作为疫苗抗原尚未进行保护性研究[26-27]。TSOL18是六钩蚴阶段早期表达的一种特异性抗原，相对较保守，这也表明TSOL18在猪带绦虫六钩蚴阶段发挥重要作用，可能与六钩蚴的入侵有关[28-29]。本研究分别将猪带绦虫重组质粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18电穿孔转化入L.lactis，将获得的阳性重组pMG36e-TSOL18/L.lactis、pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis转化菌，在无红霉素抗性和含红霉素抗性条件下，连续人工传代20次，通过质粒遗传稳定率测定和SacI/HindIII双酶切鉴定，测定质粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18在L.lactis中的遗传稳定性。结果表明，含有目的基因的质粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18在L.lactis中连续传代20代时，在无红霉素抗性条件下，质粒稳定率均为100%，在含红霉素抗性条件下，质粒稳定率均为99%，均有较好的遗传稳定性。将各代次的质粒采用限制性内切酶SacI/HindIII进行双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示大小正确，连续传至20代时，与原代质粒相符，与代伟丽等[16]和李月等[30]的报道相似。本实验结果为猪带绦虫TSOL18基因重组乳球菌疫苗在动物体内的遗传稳定性以及免疫应答效果等研究奠定基础。