许惠艳，张筱芫，杨小淦，卢晟盛，梁兴伟，陆阳清，张 明，卢克焕

(1.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁 530005;2.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005)

【研究意义】水牛是亚热带地区的特殊物种，提供重要的奶、肉供应，是畜牧产业中重要的家畜之一，但繁殖能力较低。借助胚胎生物技术可提高水牛繁殖能力，可进一步满足人们生活的需求［1］。在胚胎体外生产中，卵母细胞体外成熟质量是影响后续研究效率的关键因素之一［2］，卵子和植入前胚胎中脂肪成分对哺乳动物发育非常重要，可影响卵子成熟及胚胎附植［3］。研究影响卵母细胞体外成熟的脂肪因素，可进一步了解卵母细胞体外成熟相关机制［4］，为后续研究提供一定的理论参考。【前人研究进展】卵子质量是影响雌性生殖效率的关键因素之一［5］，在体外培养液中添加碳水化合物可对卵子成熟及胚胎发育起到关键的作用。Prates等［6］的研究表明脂肪酸β-氧化是卵子成熟及后续胚胎发育重要能量来源之一，添加脂类成分相关物质可提高卵母细胞体外成熟。Ferguson等［7］对牛卵子成熟过程的研究发现，脂肪滴的形状、体积和位置会随着脂肪分解活性而发生改变。Jin等［8］对猪卵母细胞成熟过程的研究表明，细胞内的脂肪与卵母细胞减数分裂的恢复及细胞质成熟过程相关。卵子成熟过程中，细胞内的脂肪除了位置、形成、体积等改变外，细胞内脂肪的含量和分布模式也相应发生变化。Auclair等［9］对牛成熟卵子体外成熟过程的研究表明，体外成熟后的MII卵子脂肪含量显著低于GV期卵母细胞中脂肪含量，说明卵母细胞内的脂肪可能作为卵母细胞成熟、后续受精及胚胎发育的重要能量物质。Ambruosi等［10］对马卵母细胞成熟过程的研究发现，卵母细胞内的脂肪分布随成熟阶段的变化也呈现不同的分布模式，这种现象可能与卵母细胞成熟质量相关。【本研究切入点】大型家畜成熟前后卵母细胞中脂肪含量及脂肪分布模式已有相关报道，但关于亚热带地区特有家畜水牛成熟前后卵母细胞内的脂肪含量变化及脂肪分布模式的研究还未见报道。【拟解决的关键问题】进行水牛GV期未成熟卵母细胞和MII期成熟卵母细胞中的脂肪含量及分布模式的研究，为水牛卵母细胞体外成熟相关机理的深入探讨、水牛卵母细胞体外成熟体系的优化及卵子体外成熟效率的提高提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

卵母细胞体外成熟培养液为TCM-199+26.2 mM NaHCO3+5 mM Hepes+10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)+100 μM 半胱氨酸(cysteamine)+0.5 μg/mL 促卵泡素(follicle-stimulating hormone，FSH)+5 μg/mL 促黄体素(luteinizing hormone，LH)+3%黄牛卵泡液(bovine follicular fluid，BFF)，洗卵液为 TCM-199+20 mM Hepes+5 mM NaHCO3+4%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)+0.003 g/mL 青霉素 +0.005 g/mL链霉素。TCM-199粉剂购自Gibco生物化学公司，其余药品均购自Sigma生物化学公司。

1.2 试验方法

1.2.1 未成熟卵丘－卵母细胞复合体的采集 卵丘卵母细胞复合体的收集、成熟及培养参照 Lu等［11］的方法进行。供试验的水牛卵巢从当地屠宰场取得，放在37℃的生理盐水中，并于3～4 h内运回实验室。选择卵巢中直径大小为2～8 mm的卵泡，用带有12号针头的10 mL进行未成熟卵丘卵母细胞复合体的采集。

1.2.2 卵母细胞的准备 (1)未成熟卵母细胞的准备。在体视显微镜下，选择胞质均匀、包被完整的卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)，用洗卵液洗3遍去除杂质后，一部分COCs放入含有0.1%透明质酸酶的洗卵液中，用200 μl的移液枪反复吹打去除卵丘细胞，然后在体视显微镜下，挑出卵丘细胞脱落完全、胞质均匀的GV期未成熟卵母细胞待用。

(2)成熟卵母细胞的准备。在体视显微镜下，一部分未成熟的COCs，用洗卵液洗3遍去除杂质后，再用预先平衡好的成熟液洗2遍后，放入38.5℃、5%CO2和100%湿度的培养箱中培养22～24 h后，用200 μl的移液枪反复吹打去除卵丘细胞，然后在体视显微镜下，挑出卵丘细胞脱落完全、胞质均匀、排出第一极体的MII期成熟卵母细胞待用。

1.3 卵母细胞内脂肪含量及分布模式的测定

1.3.1 卵子内脂肪分布模式的特征 外围分布(Peripheral)表示脂肪滴分布在卵母细胞的周围区域，半均匀分布(Semi-peripheral)表示脂肪滴在卵母细胞中心分布有少量的分布，多分布在皮质的外围，均匀分布(Diffuse)表示脂肪滴均匀分布在整个细胞质区域(图 1，bar=50 μm)。

1.3.2 卵母细胞中脂肪浓度及脂肪分布模式的测定 水牛卵子内脂肪含量的测定参考Paczkowski等的方法［12］进行。将GV期未成熟的卵母细胞和MII期成熟的卵母细胞分别放入4%的甲醛固定液中固定30 min，然后把待检测的卵子放入到含有10 μg/mL Nile red的洗卵液中，室温黑暗环境中染色4～5 h后，用PBS洗涤多余的染料，最后把卵子放入都载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察。所得图像用Image J软件分析荧光强度，依据荧光强度来计算卵母细胞中总脂肪含量。根据拍照的图像中脂肪在卵母细胞中的分布情况，记录脂肪的分布模式，试验重复3次。

1.4 统计分析

采用Graphpad Prism5的单因素方差分析(ANOVA)进行脂肪含量及脂肪分布模式的统计分析。

图1 水牛卵母细胞中脂肪分布模式Fig.1 Lipid distribution pattern in buffalo oocytes

2 结果与分析

2.1 GV期未成熟卵母细胞及MII期成熟卵母细胞中脂肪含量的比较

由图2可知，MII期卵子中脂肪含量显著低于GV 期脂肪含量(66.63 ±1.197 vs.70.81 ±1.328;GV:n=50，MII:n=49;P ＜0.05)，可见水牛卵母细胞在成熟过程中，卵子内脂肪含量呈下降趋势。

2.2 GV期未成熟卵母细胞和MII期卵母细胞中脂肪分布模式的比较

2.2.1 GV期未成熟卵母细胞中各脂肪分布模式的比较 从图3可见，在GV期未成熟卵母细胞中，均匀分布模式所占比例(66.00±3.26)极显著高于半均匀分布模式(30.85±4.04)和 Peripheral分布模式(3.15 ±2.30)(P ＜0.0001，下同)，而半均匀分布模式极显著高于外围分布模式。可见，在GV期未成熟卵母细胞中，脂肪主要呈现均匀分布模式。2.2.2 MII期成熟卵母细胞中各脂肪分布模式的比较 从图4可见，MII期的成熟卵母细胞中脂肪分布模式中，均匀分布模式所占比例(60.60±3.93)极显著高于半均匀(35.70±4.27)和外围分布模式(5.34±3.89)，而半均匀分布模式极显著高于外围分布模式。可见，在MII期成熟卵母细胞中脂肪多呈现均匀分布模式。

图2 GV期未成熟卵母细胞及MII期成熟卵母细胞中脂肪含量的比较Fig.2 Comparison of lipid content between immature oocytes at GV stage and mature oocytes at MII stage

图3 GV期未成熟卵母细胞中各脂肪分布模式的比较Fig.3 Comparison of lipid distribution patterns in immature oocytes at GV stage

图4 MII期成熟卵母细胞中各脂肪分布模式的比较Fig.4 Comparison of lipid distribution patterns in mature oocytes in MII stage

表1 GV期未成熟卵母细胞和MII期成熟卵母细胞中各脂肪分布模式的比较Table 1 Comparison of lipid distribution patterns between immature oocytes at GV stage and mature oocytes at MII stage

2.2.3 GV期未成熟卵母细胞和MII期成熟卵母细胞中各分布模式的比较 由表1可见，GV期未成熟卵母细胞和MII期卵母细胞中脂肪Peripheral(3.15± 2.30 vs.5.34±3.89)，Semi-peripheral(30.85±4.04 vs.35.70±4.27)和Diffuse(66.00±3.26 vs.60.60±3.93)的各分布模式所占比例差异不显著(P＞0.05)，说明水牛卵母细胞成熟前后细胞质内的脂肪分布模式没有发生改变。

3 讨论

哺乳动物的卵母细胞中储存大量的脂肪，特别是在牛、猪和山羊中含量更为丰富［13－15］。脂肪在卵母细胞发育过程中起到非常重要的作用［16］，在卵母细胞体外成熟培养体系中，学者们通过添加与脂肪代谢相关物质，优化培养体系，用以提高卵母细胞体外成熟及后续胚胎发育能力［17］。卵母细胞体外成熟技术是进行胚胎体外生产的关键技术之一，脂肪在卵母细胞内含量较为丰富，在卵母细胞体外成熟过程中发挥重要的作用［16］。Crocomo 等［18］的研究表明，山羊卵母细胞经过体外成熟后，胞质内的脂肪比成熟前含量明显减少。Auclair等［9］通过Nile red染色观察，认为牛卵母细胞成熟后的脂肪含量显著低于成熟前含量。在本试验中，通过Nile red染色对水牛GV期未成熟卵母细胞和MII期成熟卵母细胞内脂肪含量进行观察分析，发现MII期成熟卵母细胞内的脂肪含量显著低于GV期未成熟卵母细胞，这与上述前人研究结果一致，据此推测卵母细胞内的脂肪可能作为水牛卵母细胞体外成熟过程中的能量物质被卵子所利用［16］，脂肪可能作为重要的能量物质之一影响卵子成熟效率。然而，在体外成熟过程中，体外成熟液培养体系影响水牛卵母细胞内脂肪含量变化，从而提高后续受精及胚胎发育效率的机制还需进一步研究。

在GV期未成熟卵母细胞中，卵母细胞中的脂肪多以均匀模式分布。在卵母细胞内各个细胞器中，脂肪通过转运到线粒体中并发生β氧化而供能，因此其脂肪分布模式往往与线粒体的分布相关［19］。本试验中，GV期未成熟卵母细胞脂肪大多数呈现均匀分布模式，这种分布模式是否与线粒体分布存在共定位，从而利于细胞内脂肪的氧化供能还需进一步研究。MII期成熟卵母细胞中，卵母细胞中脂肪多以均匀模式分布，而且成熟卵母细胞均匀模式的线粒体分布与卵母细胞发育能力呈正相关［20］。前期研究结果表明大多数水牛成熟卵母细胞中线粒体呈现均匀分布模式［21］，说明在水牛体外成熟卵母细胞中的脂肪分布和线粒体分布模式可能存在共定位，卵母细胞内脂肪的均匀分布模式可能利于脂肪转运到线粒体内发生β-氧化，为卵母细胞发育提供能量，从而有利于水牛卵子的成熟。

卵母细胞的体外成熟过程中，依据动物品种和卵母细胞成熟阶段的不同，胞质内脂肪分布模式也不同。本试验中，水牛GV期未成熟卵母细胞和MII期成熟卵母细胞中，脂肪多呈现均匀分布模式，且这2个时期的卵母细胞各脂肪分布模式没有差异。前人研究结果表明，经体外或体内成熟后的卵母细胞，其脂肪在猪体内多呈现周边分布，而在小鼠及牛体内多呈现均匀分布［22－24］;Warzych 等［24］认为在成熟前的牛卵母细胞中，脂肪呈周边分布，成熟后呈均匀分布，这与本研究结果相似。因此，推测细胞质中脂肪分布模式可能会影响卵母细胞的质量，而分布模式因动物种类的不同而存在差异。在卵母细胞成熟过程中，卵母细胞中脂肪滴数量、大小和位置对卵母细胞成熟质量的影响机制还需要进一步探讨。

4 结论

水牛从GV期未成熟卵母细胞到MII期成熟卵母细胞的成熟过程中，卵子内脂肪含量显著降低，而水牛卵母细胞成熟前后脂肪分布模式没有发生改变，以均匀分布模式为主。