牛俊奇，黄金容，苗小荣，王道波* ，杨丽涛 ，李杨瑞

(1.玉林师范学院生物与制药学院，广西玉林 537000;2.广西农产资源化学与生物技术重点实验室，广西玉林 537000;3.广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁 530005;4.中国农业科学院甘蔗研究中心/广西农业科学院甘蔗研究所，广西南宁 530007)

【研究意义】甘蔗是我国重要的糖料作物，也是广西的支柱经济作物。全球60%的食糖来源于甘蔗，而我国甘蔗糖产量占全国食糖总产量的比例高达90%以上［1］。蔗糖分是衡量甘蔗品种优劣的最重要指标之一，探讨甘蔗体内与蔗糖代谢相关酶的酶活水平、消长规律和基因的遗传多样性，可为选育高糖甘蔗品种奠定理论基础。蔗糖转运及其在蔗茎中的积累过程十分复杂，是蔗糖合成和分解酶类在植物体内共同协作调节的结果，转化酶 (Invertase，INV)是高等植物体内控制蔗糖分解的关键酶，在蔗糖的转运、贮藏和分配中起作用［2］。而转化酶抑制子(Invertase inhibitor，InvInh)是体内调节转化酶活性的关键酶［3］。因此，对甘蔗InvInh家族基因进行筛选、克隆和组织特异性表达研究，对进一步研究InvInh对转化酶的抑制机理及其在探明蔗糖积累中所起的作用均具有重要意义。【前人研究进展】InvInh是转化酶翻译后调节的一个重要因子，存在于植物发育的特定阶段，且只对酸性转化酶起抑制作用［4］。InvInh家族基因可分为液泡转化酶抑制子(Vacuolar invertase inhibitors，VIFs)、细胞壁结合转化酶抑制子(Cell wall invertase inhibitors，CIFs)和定位不明确或同时对二者都具有抑制作用的抑制子(C/VIF)［5］。目前，已经从番茄、拟南芥、大豆、玉米和铁皮石斛等植物中克隆到InvInh基因，它们编码的氨基酸序列不保守，在不同物种间变异较大，但该类蛋白N端都具有4个不对称的α螺旋结构和4个保守的Cys位点［2，6］。InvInh和INV以离子键相结合，能形成InvInh/INV复合物，当纯化的InvInh蛋白加入烟草悬浮培养细胞，INV酶活性受到抑制［7］。蔗糖浓度［8］、pH 值［9］和 SnPK 磷酸化［10］等是影响InvInh与INV结合的重要调控因子，它们或通过与InvInh蛋白结合形成复合物，抑制其与INV结合，或影响InvInh与INV的结合效率。InvInh酶活性具有剂量依赖型，其使INV酶活性降低50%的 Ki值为 3.82 ×10－5mol/L［11－12］。课题组前期从甘蔗中克隆到一个SoInvInh1基因，相关性分析表明在甘蔗成熟期蔗茎中SoInvInh1基因可能与酸性转化酶活性密切相关［13］。蔗茎中SAI酶和NI酶活性降低有利于蔗糖积累，而节间细胞壁结合转化酶(CIN)酶活性提高，有利于蔗糖从低浓度节间向高浓度节间的运输。而节间SoInvInh2基因表达量与CIN酶活性呈正相关，推测该基因可能是节间CIN酶活性重要调节因子［14］。【本研究切入点】在前期对甘蔗INV家族基因表达和功能研究的基础上，拟从NCBI基因库 Genbank筛选 InvInh基因，利用Vector NTI 11.0软件在InvInh基因核苷酸序列保守区域设计引物，采用同源克隆技术从甘蔗中克隆InvInh家族基因。【拟解决的关键问题】根据玉米ZmInvInh2基因核苷酸序列，采用同源克隆和热不对称交错PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，Tail-PCR)技术，以甘蔗品种GT28幼茎cDNA为模板，克隆甘蔗InvInh家族基因成员，利用生物信息学软件分析InvInh蛋白的理化特性和蛋白结构，并利用qRT-PCR分析InvInh在甘蔗不同组织部位的表达特性，为后续深入研究该基因在甘蔗蔗糖代谢和积累中的作用的提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以特早熟、特高糖、高产、宿根性好和抗逆性强，在广西南宁地区易于开花的甘蔗品种桂糖28号(GT28)为材料［15］。于2012年1月20日种植于广西大学农学院甘蔗资源圃，分别在甘蔗不同生育期取样:伸长期(自甘蔗开始拔节起至伸长基本停止的时期)、工艺成熟期(蔗茎中蔗糖分积累达到最高峰，蔗汁纯度最适合压榨制糖的时期)、生理成熟前期(甘蔗生长锥分化为花芽到未抽穗的时期)、生理成熟后期(甘蔗抽穗之后到开花结实时期)，相应的取材时间为2012年8月22日、2012年12月22日、2013年1月22日和2013年2月22日。采样时以顶端第1片完全展开叶为+1叶，即成熟叶，处于顶端中心位置还没有展开的叶为幼叶，甘蔗靠近茎基部的叶片为老叶。幼茎为幼叶包裹的未成熟茎，成熟茎为蔗茎中部已经完全成熟的茎，老茎为靠近蔗茎基部的茎。

1.2 试剂和仪器

RNA提取TRIzol试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司;RNA反转录试剂盒购于Fermentas(美国);Ex Taq酶、dNTPs、pMD18-T 载体、Genome Walking Kit、PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser和SYBR Premix Ex TapⅡ购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。供试特异引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实时荧光定量PCR采用ABI Stepone Plus型荧光定量PCR仪(美国)。

1.3 转化酶抑制子SoInvInh2全长序列的克隆

1.3.1 5'片段克隆 以报道的玉米 ZmInvInh2(登录号EU951975)基因的cDNA序列，运用NCBI网站上Blastn程序在GenBank数据库中进行同源序列搜索，选取与甘蔗亲缘关系较近植物的核苷酸序列进行比对分析，在其保守性较高的区域设计1对特异引物H2F1和H2R1(表1)，用于SoInvInh2中间片段的克隆。以甘蔗幼茎cDNA为模板，引物H2F1和H2R1的PCR扩增程序:94℃预变性5 min;94℃变性50 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化后，将其连接到pMD18-T体上，连接产物转入感受态细胞DH5α，进行蓝白斑筛选。挑选白色单菌落，采用通用引物M13进行菌液PCR扩增，将能扩增出目的条带的菌液，送深圳华大基因研究院进行测序验证。

表1 甘蔗SoInvInh2基因的克隆和实时荧光定量PCR引物Table 1 Primers sequences for cloning and qRT-PCR of SoInvInh2 gene

1.3.2 3'片段克隆 以甘蔗幼茎RNA 为模板，利用引物GZS反转录合成cDNA。依据上一步克隆到的5'片段序列，设计3条特异性上游引物H2F2、H2F3和H2F4(表1)。下游引物为XP1，按照Genome Walking Kit试剂盒说明书进行Tail-PCR扩增。第1轮PCR扩增:以甘蔗幼茎cDNA为模板，扩增体系为 50 μl，含 cDNA 模板 4.0 μl、dNTP Mixture(2.5 mmol/L)8.0 μl、10 × LA PCR Buffer II(Mg2+Plus)5.0μl、LA Taq(2.5 U/μl)0.5 μl、上游引物 H2F2(100 pmol/μl)1.0 μl、下游引物 XP1(10 pmol/μl)1.0 μl、ddH2O 30.5 μl。其 PCR 扩增条件如下:94℃ 1 min，98℃ 1 min;94℃ 30 s，61.5℃1 min，72 ℃ 2.5 min，进行 5 个循环;94 ℃ 30 s，25℃ 3 min，72 ℃ 2.5 min;94 ℃ 30 s，61.5 ℃ 1 min，72 ℃ 2.5 min，94 ℃ 30 s，61.5 ℃ 1 min，72 ℃ 2.5 min，94 ℃ 30 s，42 ℃ 1 min，72 ℃ 2.5 min，进行15个循环;72℃ 10 min，4℃保存。第2轮PCR扩增:取1.0 μl上述反应的PCR产物作为模板，以H2F3和XP1为引物，引物H2F3的退火温度为60℃，扩增反应液和扩增体系同第1轮扩增。第3轮扩增体系与第2轮相同，引物H2F4退火温度为61.5℃。取第3轮PCR扩增产物进行电泳检测，产物经胶回收纯化后克隆到pMD18-T载体，经菌液PCR扩增检测后，送深圳华大基因研究院测序验证。

利用软件ContigExpress将克隆到的2个核苷酸序列进行拼接，然后利用 NCBI网站上的 Open Reading Frame Finder对拼接结果进行编码区分析。在编码区序列设计2对引物:H2F11、H2F12、H2R11和H2R12(表1)。分别以花序轴和花序cDNA为模板，引物组合:A:H2F11和 H2R12;B:H2F12和H2R11;C:H2F12和 H2R12。PCR扩增程序为94℃预变性5 min;94℃变性50 s，56～60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环;最后72℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳分析3对引物的PCR扩增特异性，并进行测序验证。

1.4 生物信息学分析

利用 http://web.expasy.org/protparam 分析编码蛋白的氨基酸组成、理论分子量和等电点;利用http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html分析跨膜结构;利用http://linux1.softberry.com分析蛋白的亚细胞定位;利用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP 分析蛋白质信号肽;利用 http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan 分析蛋白的活性位点;利用Vector NTI Advance 11.0进行基因氨基酸序列同源性比对分析;利用MEGA7.0软件构建基因系统进化树。

1.5 荧光定量PCR

经引物扩增特异性和扩增效率验证，SoInvInh2基因荧光定量引物为T2F22和T2R22(表1)，内参引物和qRT-PCR扩增体系参照牛俊奇等［13］的方法。采用2－ΔΔCT法分析基因的相对表达量。

1.6 统计分析

试验数据采用Excel 2007进行统计分析及制图。

2 结果与分析

2.1 SoInvInh2基因的克隆

从引物H2F1和H2R1的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果可见(图1-A)，PCR扩增产物电泳条带清晰且单一，序列测序结果为623 bp。利用Blastn进行同源性比对分析，该序列与高粱(XM002447788)和玉米(EU966246)转化酶抑制子同源性分别为86%和85%，说明克隆到的是甘蔗InvInh基因，该基因与甘蔗SoInvInh1(KF575175)核苷酸序列同源性为60%，因此克隆到的是一个新的甘蔗InvInh基因家族成员，命名为:SoInvInh2。该基因在 GenBank数据库注册号为 KF575170。利用Tail-PCR扩增出PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测如图1-B所示，扩增条带单一，序列测序结果为327 bp。

利用ContigExpress将5'和3'片段核苷酸序列进行拼接，获得SoInvInh2全长cDNA序列，全长927 bp，其中编码区序列为651 bp，编码216个氨基酸，5'UTR(Untranslated Region，非翻译序列)长2 bp，3'UTR长274 bp，并带有真核生物典型的poly A尾巴(图2)。

图1 PCR扩增结果电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product

分别以花序轴和花序cDNA为模板，引物对A、B和C的PCR扩增产物电泳检测如图3所示。引物对A扩增出的条带，经测序验证为非目的基因。引物对B在花序轴cDNA扩增的条带清新，但在花序cDNA中扩增的结果不理想。而引物对C在花序轴和花序cDNA中均能扩增出目的条带，经测序序列大小为651 bp，与拼接结果的核苷酸序列同源性为99.8%，说明引物对C可以用于扩增SoInvInh2基因编码区序列。而以甘蔗gDNA为模板，引物对C的PCR扩增产物经测序大小也为651 bp，与SoInvInh2基因的cDNA核苷酸序列同源为100%，说明SoInvInh2基因不含内含子序列。

图2 SoInvInh2基因的cDNA序列及预测氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of SoInvInh2 gene

图3 SoInvInh2开放阅读框验证Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR product of SoInvInh2 gene

2.2 SoInvInh2蛋白的生物信息学分析

利用BioXM 2.6软件对SoInvInh2编码区核苷酸序列进行分析，序列含A(腺嘌呤)111个、G(鸟嘌呤)186个、C(胞嘧啶)270个、T(胸腺嘧啶)84个，GC含量为70.05%，A+T含量为29.95%。该蛋白预测分子量为22.98 kD，等电点pI为7.8。带负电荷的氨基酸占19.44%，带正电荷的氨基酸占10.19%。SignalP4.1预测表明，SoInvInh2蛋白不存在信号肽。该蛋白的不稳定指数为32.34，为稳定蛋白。平均疏水性为 －0.034，为亲水性蛋白。TMHMM Server v.2.0预测该蛋白在N端具有跨膜结构。49～206 aa是PMEI蛋白的保守结构域，该蛋白属于InvI/PMEI家族成员。该蛋白含有3个糖基化位点:59～62、96～99和106～109 aa;3个络蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点:62～65、78～81和141～144 aa;丙氨酸富集区:69～157 aa。

利用 http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred 对 So-InvInh2编码蛋白的二级结构进行预测(图4)，二级结构有8个 α-螺旋，不含 β-折叠。其中 α-螺旋占72%、无规则卷曲占23%，延伸链占5%。利用Phyre2预测SoInvInh2蛋白的三级结构具有4个α-螺旋。

运用Vector NTI Advance 11软件上的AlignX对不同植物的InvInh的氨基酸序列进行比对分析，甘蔗SoInvInh2与玉米、高粱、水稻、拟南芥和马铃薯InvInh2的氨基酸序列的同源性分别为81%、80%、60%、37%和35%。InvInh2s蛋白在5'端同源性较低，在单子叶和双子叶植物之间，氨基酸序列同源性低于40%。9个不同来源的氨基酸序列比对结果如图5所示，InvInh2s蛋白在3'端同源性较高，其中4个保守的 Cys位点，分别位于第2、3、7和8个α-螺旋上。

2.3 InvInhs系统进化分析

利用MEGA7.0软件构建InvInhs系统进化树(图6)，植物InvInhs可以聚为4类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。其中Ⅰ类为单子叶植物InvInh2，Ⅱ类为双子叶植物InvInh2，Ⅲ类为单子叶植物InvInh1，Ⅳ为双子叶植物InvInh1。甘蔗SoInvInh1和SoInvInh2分别属于Ⅲ类和Ⅰ类。从进化关系看，Ⅰ类和Ⅱ类进化关系比较近，而与同是单子叶植物类的Ⅲ类的进化关系较远，说明InvInhs蛋白又可以分为2个大类:Ⅰ和Ⅱ归为一类、Ⅲ和Ⅳ又归为另一类。

2.4 SoInvInh2基因在甘蔗不同生长期的时空表达分析

图4 SoInvInh2蛋白的二级结构Fig.4 Predicted secondary structure of SoInvInh1 protein

图5 SoInvInh2氨基酸序列与其他物种氨基酸序列多重比对Fig.5 Alignment of SoInvInh2 its homologous based on amino acid sequences

在甘蔗伸长期(图7 A)，SoInvInh2的表达量在成熟茎中表达量最高，在成熟叶中最低，成熟茎中基因表达量是成熟叶中的70.9倍。在叶中SoInvInh2表达量呈现出老叶＞幼叶＞成熟叶，在茎中SoInvInh2表达量呈现出成熟茎＞老茎＞幼茎。在甘蔗工艺成熟期(图7-B)，SoInvInh2在幼叶中表达量最高，老叶次之，成熟茎中表达量最低。叶中该基因表达呈“幼叶＞老叶＞成熟叶”的趋势，其中SoInvInh2在幼叶中基因的表达量是老叶的2.5倍，是成熟叶的2.2倍。在茎中SoInvInh2表达量呈现出“幼茎＞老茎＞成熟茎”，幼茎中基因表达量是成熟茎中的3.4倍。在甘蔗生理成熟前期(图7-C)，SoInvInh2在茎中基因表达量呈幼茎＞成熟茎＞老茎。SoInvInh2表达量在幼茎中最大，老叶中次之，成熟叶中最低。在甘蔗生理成熟后期(图7-D)，叶中SoInvInh2表达量表现为:老叶＞幼叶＞成熟叶，茎中表现为:成熟茎＞幼茎＞老茎。SoInvInh2在老叶中基因相对表达量最大，花序中次之，幼茎中最低，其中老叶中基因表达量是幼茎中的11.7倍。SoInvInh2在花序中基因表达量是花序轴中1.6倍。

3 讨论

克隆基因3'侧翼未知序列常采用3'RACE试剂盒，一般都能克隆获得基因未知核苷酸序列，但本研究前期采用3'RACE试剂盒并未克隆到SoInvInh2基因3'片段序列，而采用Tail-PCR技术能成功克隆出。Tail-PCR技术虽然需要较多引物组合，扩增条件精细，但其操作简便、快捷、扩增特异性高，常用于基因侧翼序列的克隆［16］。进一步分析发现 SoInvInh2基因的核苷酸序列GC含量高达70%以上。PCR扩增GC含量较高的基因，退火时核苷酸序列容易形成复杂的发夹结构从而干扰扩增，可以适当减少退火时间、或在PCR反应体系中加入亚甲基砜和甜菜碱都能提高引物的扩增效率［17］。本研究也证明采用Genome Walking Kit试剂盒和引物XP1组合适用于扩增甘蔗高GC含量的基因。

InvInh蛋白具有4个不对称的α螺旋结构和4个保守的Cys位点，它们在稳定InvInh蛋白构型和功能中起作用。4个不对称α螺旋在维持InvInh蛋白结构的完整性中起重要作用，而4个α螺旋结合区是与酸性转化酶结合的重要区域［18］。4个保守的Cys位点，能形成2个分子内二硫键，具有稳定肽链空间结构的作用。而分子内二硫键内被DTT破坏，InvInh 蛋白即失去抑制作用［2］。Hothorn 等［9］进一步研究证实烟草InvInh蛋白在高温和低pH值下能保持稳定，就是由于Cys间形成分子内结构稳定二硫桥的缘故。本研究克隆到的SoInvInh2蛋白具有4个不对称的α螺旋结构和4个保守的Cys位点，因此推测该蛋白可能具有抑制INV酶活性的作用。

图6 InvInhs进化关系分析Fig.6 Phylogenetic tree of InvInhs protein

图7 甘蔗不同生长时期SoInvInh2表达分析Fig.7 Expression analysis of SoInvInh2 at different growth stages of sugarcane

系统进化分析表明，植物InvInhs蛋白可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4个亚家族。从进化关系看，Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ亚家族蛋白的亲缘关系较近，而Ⅰ和Ⅲ亚家族蛋白的亲缘关系较远，这与Di Matteo等［5］将InvInh分成液泡转化酶抑制子VIF和细胞壁结合转化酶CIF的分类结果相一致，即VIF与CIF家族蛋白之间所推导的氨基酸序列的同源性较低。由于植物液泡转化酶(SAI)和细胞壁结合转化酶(CIN)都是多家族基因，提取、分离和纯化这两种酶比较困难，且InvInh/INV复合物具有高度特异性，InvInh对不同物种INV抑制作用存在较大差异［19］。因此Ⅰ和Ⅱ亚家族成员是属于VIF亚家族，还是属于CIF亚家族，还需要进一步研究。但该类蛋白具有明显的共同特征:属于非糖基化蛋白，其分子量为17～23 kD;具热稳定性，短时高温仍具有抑制INV活性的作用;对INV具有交叉抑制作用［20］。

基因表达模式分析可为基因功能的揭示提供重要线索。本研究结果表明SoInvInh2基因表达具有组织表达特异性，但该基因在甘蔗不同生育期叶和茎中的表达模式无明显规律。前期研究表明甘蔗成熟期节中SoInvInh2基因与CIN酶活性呈正相关性，表明二者可能存在协同表达［14］。在烟草中过表达SoInvInh2基因，转基因植株中CIN酶活性在叶、根和茎中的酶活性与SoInvInh2基因表达量呈显著负相关，说明过表达SoInvInh2基因，可能翻译成了有活性的SoInvInh2蛋白，从而抑制了 CIN的酶活性［21］。在番茄中沉默InvInh1基因的表达，可以提高CIN酶活性，抗寒性提高。而过表达InvInh1，能抑制 CIN酶活性，己糖含量降低，对低温敏感［21－22］。在番茄、大豆和拟南芥研究中都发现，CIF能抑制CIN酶活性，能延缓细胞衰老和增加种子重量［24－25］。大量研究表明，通过转基因技术过表达InvInh基因，能抑制酸性转化酶的活性，进而调节蔗糖代谢和库强。下一步将构建SoInvInh2基因正义和RNAi干扰植物表达载体，并将其导回甘蔗中。通过转基因植株性状表现，结合InvInh2基因表达特性验证甘蔗SoInvInh2基因的功能，阐明甘蔗糖分积累过程中InvInh与INV的互作机制，为能动调控甘蔗糖分积累提供参考。

4 结论

从甘蔗中克隆到一个新的转化酶抑制子基因SoInvInh2，编码216个氨基酸，分子量为22.98 kD，等电点为7.8。核苷酸序列GC含量在70%以上，属于高GC含量基因。基因不含内含子序列，其编码蛋白具有4不对称的α-螺旋和4个保守的Cys位点。49～206 aa是PMEI蛋白的保守结构域，属于InvI/PMEI家族成员。植物InvInhs蛋白可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四个亚家族，SoInvInh2蛋白属于Ⅰ亚家族。SoInvInh2基因具有组织表达特异性，但在甘蔗不同生育期叶和茎中的基因表达模式无明显规律。