李永洪，李传旭，刘成元，何 珊，向箭宇，谢 戎*

(1.四川省农业科学院水稻高粱研究所/农业部西南水稻生物学与遗传育种重点实验室/国家水稻改良中心泸州分中心，四川 德阳 618000;2.华中农业大学生命科学技术学院，湖北武汉 430070)

【研究意义】水稻叶片是光合作用最重要的器官，其发育形态和叶绿素含量直接决定了产量的高低，水稻产量的90% ～95%来自于叶片的光合作用产物［1］。【前人研究进展】前人研究表明，叶绿素是植物吸收、传递和转换光能最主要的色素，在一定范围内，叶绿素含量和光合速率呈正相关关系，而光合速率的高低又直接决定了产量的高低［2－5］。由于氮素是叶绿素的主要组成部分，氮肥不足，叶绿素含量低，造成叶片短小，从而导致减产。但过多的施用氮肥导致氮素利用率较低，不仅加大农业生产成本，也带来严重的环境问题［6－8］。因此，在不影响产量和品质的前提下控制化学肥料的施用量，提高肥料的利用效率，是现代农业的必然要求。叶片叶绿素含量的差异，反应了不同基因型对氮素的吸收状况与叶绿素合成效率的差异，也有利于与氮素吸收相关基因的发掘。实际生产和研究工作中，常用叶绿素含量的高低来衡量植株营养水平，光合作用能力和逆境胁迫状况［9－10］。与水稻许多农艺性状一样，水稻叶片叶绿素含量也是数量性状。近年来，不同研究者利用不同遗传群体对水稻叶片叶绿素含量QTL进行大量的定位研究，为阐明叶绿素的分子遗传机制和高光效育种奠定了基础。目前定位出的叶绿素含量相关 QTL较多，但被克隆的却较少。qLSCHL4是一个控制叶形和叶绿素含量的主效QTL(qLSCHL4)，图位克隆和表达分析表明qLSCHL4是NAL1的等位基因，不仅控制叶形和叶绿素含量，还影响每穗粒数，属一因多效［11］。研究发现Ghd7是自然变异控制叶绿素含量的主效QTL，Ghd7负向调节叶绿素含量［12］。一个在低氮条件下影响叶绿素含量的主效QTLqFCC7L，可能与水稻耐低氮胁迫能力有关，并将其定位在第7染色体长臂124.5 kb的区间内，对其候选基因分析表明，小肽转运蛋白基因OsPRT4(LOC-Os07g41250)最有可能与qFCC7L有关，双亲在候选基因上存在序列变异和基因表达量的差异，OsPRT4主要在叶片和根中表达，这也与推测其具有吸收和转运氮素的能力相符合［13］。【本研究切入点】本研究小组发掘的籼稻种质A232，中抗多种水稻害虫［14］。利用该材料进行抗虫转育研究是本研究团队近年来的主要研究内容之一。本研究拟利用“岗46B/A232”重组自交系群体，进行不同年度及不同叶位叶片叶绿素含量的QTLs分析，【拟解决的关键问题】以期为水稻高光效育种提供新的基因资源，为抗虫种质A232的杂交转育及组配出高产优质抗虫品种提供分子标记及指导依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以岗46B为母本，A232为父本进行杂交，按“一粒传”法构建重组自交系［15］，本研究以重组自交系群体的173个家系和双亲作为试验材料。

1.2 田间试验及叶绿素测定

田间试验分别于2016，2017年在四川省农业科学院水稻高粱研究所泸县福集镇试验基地进行。2年均于当年3月20日播种所有试验材料，秧龄25 d左右移栽。每个家系种植5行，每行10株，株行距为20.0 cm×26.7 cm。分别于分蘖期(5月30日)和抽穗期(7月15日)用便携式叶绿素仪(SPAD-502.Monito，Japan)测定两亲本及各家系主茎的倒1、2和3叶叶片的SPAD值。测量时，取叶片中部位置重复测定3次，每个家系测定10片叶，取平均值用于换算该家系叶片叶绿素含量。计算分蘖期倒1、2和3叶叶绿素含量(分别简称 CTFL、CTSL和CTTL)，抽穗期倒1、2和3叶叶绿素含量(分别简称CHFL、CHSL和CHTL)，叶绿素仪测定的SPAD值与叶绿素含量之间的换算公式为:Y=0.1285X－0.5656，式中，X为叶绿素仪测定的SPAD值，Y为叶绿素含量(mg·dm－2)［16］。

1.3 遗传图谱构建和QTL分析

采用在两亲本间存在差异且带型清晰的130对SSR引物对RIL群体株系进行基因型分析，构建SSR标记遗传连锁图谱［15］。利用 ICIM(QTL Ici-Mapping)软件对所考查的叶片叶绿素含量性状进行QTLs定位分析，判断QTL存在的阀值LOD≥2.50。QTL命名方法参照McCouch等提出的方法［17］。

2 结果与分析

2.1 RIL群体叶绿素含量与产量性状间的关系

从表1可见，各叶绿素含量性状间呈极显著正相关，与单穗重直接相关系数不大，抽穗期倒3叶叶绿素含量与谷粒厚两年中均呈极显著正相关关系，分蘖期倒2叶叶绿素含量与谷粒厚两年中分别呈极显著和显著正相关。其余各叶绿素含量性状与各粒形性间的相关性在2017年均不显著。而在2016年中，分蘖期倒2叶叶绿素含量与千粒重达显著正相关，分蘖期倒3叶叶绿素含量与谷粒厚达极显著正相关，抽穗期倒1叶叶绿素含量与谷粒长和谷粒长宽比达显著正相关;抽穗期倒2叶叶绿含量与谷粒长呈显著正相关，与谷粒厚和千粒重呈极显著正相关。

2.2 RIL群体及其亲本的叶绿素含量性状的表型变异

由表2可知，在分蘖期和抽穗期2个生长阶段，2年中双亲顶部三片叶的叶绿素含量存在明显差异，岗46B高于A232。在RILs群体中，不同家系间叶绿素含量变异范围较大，上三叶叶绿素含量均存在超亲分离，偏度和峰度分析表明，2年上三叶叶绿素含量均表现近正态的连续分布，表明叶片叶绿素含量为多基因控制的数量遗传，可以进行QTL定位分析。

表1 各叶绿素含量性状与粒形及产量性状的相关分析Table 1 Correlation coefficients among chlorophyll contents and grain shape traits and grain yield in the Gang46B/A232 RIL population

表2 亲本与重组自交系群体各时期的叶绿素含量表现与分布Table 2 Phenotypic variation and distribution of chlorophyll content in the RIL population and its parents at different stages

表3 RIL群体叶片叶绿素含量的QTL位置与遗传效应Table 3 Identification of QTL for chlorophyll content of leaf in RIL population and their genetic parameters estimated

2.3 利用复合区间作图法对叶绿素含量的QTL检测

利用完备区间作图法对岗46B/A232的RIL群体进行叶绿素含量QTL分析，2016年共检测到18个 QTL，分布于第1、2、3、4、5 和7 染色体，LOD 值介于2..59 ～7.49，单个 QTL 分别解释相应性状变异的5.91% ～38.69%。对2017年分蘖期和抽穗期调查的顶部3片叶的叶绿素含量进行分析，共检测到12个 QTL，分别位于第1、2、3和4染色体上，LOD值介于2.95～4.83，分别解释叶片叶绿素含量变异的6.83% ～15.69%(表3)。

2016年控制分蘖期和抽穗期倒1、2和3叶叶绿素含量的QTL在第3染色体RM231-RM3392区间上，而根据2017年表型值在此区间上只有抽穗期的倒1叶和倒2叶叶绿素含量QTL被检测到。2016年检测到在分蘖期和抽穗期控制倒3叶叶绿素含量QTLq16CTLT-3-1和q16CTLH-3-2，位于第3染色体RM3867～RM1230区间上，但根据2017年叶绿素表型值，在此区间上检测到的是控制抽穗期倒1叶叶绿含量的QTLq17CFLH-3-2。根据2016年表型值，在第1染色体RM140-RM493区间上检出的有控制分蘖期倒1叶叶绿素含量QTLq16CFLT-1-1、分蘖期倒3叶叶绿素含量QTLq16CTLT-1-1、抽穗期倒1叶叶绿素含量QTLq16CFLH-1-1和抽穗期倒2叶叶绿素含量QTLq16CSLH-1-1，但根据2017表型数据，未能在此区间检测叶绿素含量相关性状QTL。在第2染色体 RM1358～RM71区间，只有2017年的表型值在此区间上检出q17CSLT-2-1和q17CTLT-2-1 2个叶绿素含量相关QTL。在抽穗期，2016年表型值检出4个控制倒三叶叶绿素含量QTL，但根据2017的表型值却未能检测到控制倒三叶叶绿素含量的QTL。

3 讨论

3.1 叶绿素含量与产量

叶绿素是水稻进行光合作用的物质基础，改善叶片叶绿素含量可以提高光合效率，进而提高水稻产量和品质。本研究简单相关分析表明，各叶绿素含量相关性状与单穗重并无显著相关关系，但其与产量密切相关的粒形性状和千粒重呈现出各种复杂相关关系，有的相关性达显著或极显著水平。可见，不同叶位叶绿素含量与水稻产量有着密切的关系［18－19］，并且可能影响稻谷的品质。

3.2 本研究定位的叶绿素含量QTL与前人定位结果的比较

本研究检测到的控制分蘖期倒1叶叶绿素含量QTLq17CFLT-3-2(RM5625～RM1350)与孙小霞等检测到的叶绿素含量QTLqChl-3c(RM565～RM168)，姜树坤等检测到的分蘖期叶绿素含量QTLqCT3a(PM380～RM426)染色体位置区间部分重叠［20－21］。

胡颂平等定位的叶绿素含量QTLqCC3c(RM22～RM231)，范淑秀等定位的叶绿素含量QTLqChla-3b、qChlb-3b、qChlt-3b 和 qChlxc-3b(RM231 ～RM22)与本研究定位到的叶绿素含量相关QTL区间(RM231～RM3392)具有相近或相同的染色体位置［22－23］。本研究中，该区间两年共有8次被检出，说明该位点上控制叶片叶绿素含量的基因受环境影响较小，表达稳定。

孙小霞等检测到的qChl-4(RM470～RM451)，胡颂平等定位的qCC4b(RM255～RM349)，Jiang等定位的 qCH4，qCM4b和qCTH4(RM255～RM559)及Zhang等定位的qLSCHL4，阿加拉铁等检测到的qCHL4-1(RM280～RM1113)、qCHL4-2(RM255～RM280)与本研究检测到的叶绿素含量QTLq17CTLT-4-1(RM280～RM113)和q17CSLH-4-1(RM5473～RM303)具有相同的染色体位置或位置部分重叠［11，20，22，24－25］。

姜树坤等定位的 qCH7(RM478～RM429)、qCM7a(RM214)和 qCM7b(RM18～RM429)区间，范淑秀等定位的 qChla-7、qChlb-7、qChlt-7和qChlxc-7(RM18～RM118)区间，Ye等定位的在低氮条件影响顶三叶叶绿素含量的主效QTLqFCC7L均位于本研究检测到的q16CFLH-7-2(RM21253～RM248) 区间上［13，21，23］。本研究中，该位点只在2016年表型值中被检测到，且其遗传效应值较大，该位点的表达是否受低氮条件的影响，需进一步确认。

3.3 叶绿素含量QTL的多样性及表达的稳定性

定位用的遗传群体、分子标记种类及QTL作图方法的不同，以及性状值受环境条件影响等因素，前人对水稻叶片叶绿素含量QTL定位研究结果差异较大。目前定位出的叶绿素含量相关QTL较多，但被克隆的却较少。有研究表明，不同生长阶段和不同叶位叶绿素QTL的表达表现出明显特异性，如QTLqFCC7L在始穗期低氮条件影响顶三叶叶绿素含量，在抽穗期低氮条件下也控制倒一和倒三叶叶绿素含量［13］。本研究定位在第3染色体RM5625～RM1350区段和RM231～RM3392区段，第4染色体RM280～RM1113区段和RM5473～RM303区段，第7染色体RM21253～RM248区段的叶绿素含量QTL位点与前人研究结果一致［11，13，20－25］，说明这些区间上的QTLs受环境影响较小，在水稻不同生长阶段能稳定表达，有利于提高叶片叶绿素含量，增强光合作用，从而能提高水稻产量和品质。