福建中医药大学药学院，福建 福州 350122

近年来，中医药备受关注，根据国家有关政策，食药两用果树的绿色发展已被定为发展目标和重点扶持方向。提高食药两用中药材的用途和利用价值，根据中医药理论配伍，生产能促进人体健康且又具有高附加值的功能果品产品，对改善人们生活习惯，提高生活质量具有重要意义。咳嗽是一种临床常见病证，中医病机是由风邪犯肺，肺宣发肃降功能受郁，进而肺气上逆之证。随着人们对咳嗽病因、病机及治疗方法认识的逐渐深入，人们更重视环境因素、鼻、咽喉疾病所致的病因[1]。针对干燥环境特别是空调环境下引起的咽喉疾病所致咳嗽，课题组经过民间调查及临床实践，总结以乌梅为君，青果(橄榄)、橘皮为臣，粳米、茶为佐使，组成青梅复方治疗燥热咳嗽、咽喉疼痛等具有一定疗效。青果、乌梅作为我国天然的药食两用物品，具有独特的功效和很好的营养保健价值。两者更多用于副食品，而用于镇咳祛痰产品开发甚少[2]。因此课题组取青梅复方之利咽止咳功效，开发防治“空调病”所造成的咳嗽口干，咽喉干燥等问题的功能性饮料，通过正交试验对配方进行优选，并对添加的稳定剂进行考察；对饮料中的固体含量和保存过程中致病菌产生情况等进行质量检测，并采用没食子酸[3]以及橙皮苷[4]为指标利用高效液相色谱对饮料主要成分进行定性分析，研究复方青梅饮料的制作工艺。

1 仪器与材料

1.1 仪器 WYT-32手持糖量计(泉州光学仪器厂)、HH-501超级恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)、LXJ-IIB低速多管离心机(上海安亭仪器厂)、LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)、RE-3000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、DLSB-5120低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司)、LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)、AR2140电子平台(梅特勒·托利多仪器有限公司)、A10超纯水(美国Millipore-Q公司)等。

1.2 试剂 碳酸氢钠(食品级，青岛优索化学科技有限公司)、海藻酸钠(食品级，郑州祥瑞生物科技有限公司)、羧甲基纤维素钠(CMC)(食品级，江阴市恒达化工有限公司)、苯甲酸钠(食品级，滕州市藤宝化工有限公司)、卡拉胶(批号：2016011217，滕州市香凝生物工程有限公司)、果胶酶(批号：16070409，南宁庞博生物工程有限公司)、月桂基硫酸盐胰蛋白肉汤(批号：20160303，国药集团化学试剂有限公司)、琼脂培养基(CMO325，英国OXOID公司)、乌梅(批号：20170902，福建省永泰县永丰果子厂)、青果(批号：20171022，福建青橄榄销售有限公司)、橘皮(批号：20160109，福建尤溪仙锦药业有限公司)、小米(批号：20170805，江苏淮安禾香源米厂)、茶叶(批号：20171106，福建省安溪县升美茶业有限公司)、甲酸(批号：20171204，上海展云化工有限公司)、甲醇(批号：20170605，上海展云化工有限公司)。

2 工艺研究方法与结果

2.1 制备青果提取液

2.1.1 青果原料选择 青果要求为无病虫害无霉变、无腐烂的新鲜果实，大小均匀，除去枝叶等杂物。

2.1.2 热烫 取洗净之后的青果按1∶6的料液比，同时加入含有所制备青果汁体积的0.1%的碳酸氢钠的沸水中热烫30 min，去除表皮蜡质层，使果肉组织软化。

2.1.3 破碎榨汁 通过手工去核，再将热烫的残留液与去核之后的果肉混合榨汁，重复三次保证充分榨汁。

2.1.4 酶解 将破碎榨汁之后的汁液中加入0.1%的果胶酶，并在55 ℃水中水浴处理4 h，其间每隔一小时充分搅拌一次。

2.1.5 过滤 将酶解后的果汁用5000 r·min-1的离心机离心10 min，取上层澄清的青果提取液备用[5]。

2.2 制备乌梅提取液 乌梅∶水按1∶6料水比例，在95 ℃浸提30 min，冷却去核打浆制得粗浆液，用离心机在转速为5000 r·min-1，时间为10 min下离心后过滤，取上层澄清的乌梅提取液备用[6-7]。

2.3 制备小米提取液

2.3.1 挑拣、清洗；

2.3.2 蒸煮 取陈米按照1∶20的比例，蒸煮30 min，使米淀粉充分糊化，破坏淀粉颗粒，舒展淀粉分子。

2.3.3 打浆 利用打浆机打浆得到粗米汁。

2.3.4 分离 采用低速离心分离将小米提取液与米渣分离，转速：5000 r·min-1，时间：10 min。

2.4 制备橘皮提取液 取干净无霉变橘皮，粉碎，按照料液比1∶20 g·mL-1(质量体积比)，蒸煮15 min。用200目纱布过滤，得滤液备用[8]。

2.5 制备茶提取液

2.5.1 选料 茶叶精选时需满足优质、具有香气、无发霉现象等条件。

2.5.2 浸提 加90 ℃水浸泡茶叶，将茶杯置于90 ℃恒温水浴箱中，浸泡时间5 min，茶水比为1∶20，使茶叶中有效保健成分充分浸出。

2.5.3 过滤 用100目的滤布滤出茶提取液，茶叶放回杯中备用。滤得的茶提取液呈亮黄色[9]。

2.6 工艺正交试验 选取饮料的主要成分青果、乌梅、橘皮、小米、茶叶以及糖这六个因素设计工艺的三水平的L18(36)正交试验因素水平表，见表1。调配后的饮料由20名不同年龄层的食品专业人员根据口感、颜色、香气等感官综合评定，见表2。

表1 复方青梅饮料正交试验设计 (%)

表2 复合汁感官评价参考标准表[10]

2.7 工艺正交试验结果 由表3、4可知，影响最佳配方工艺的因素主次顺序为：B>F>D>C>E>A，即乌梅>糖>茶>橘皮>小米>青果。通过方差分析，青果(A)、乌梅(B)、橘皮(C)、茶(D)、小米(E)、糖(F)对配方工艺的影响均达到显著性水平(P<0.05)，配方工艺的最佳工艺条件是：A3B1C3D2E1F3，即青果提取液24%，乌梅提取液3%，橘皮提取液14%，小米提取液10%，茶提取液8%，糖3%。

表3 复方青梅饮料的正交试验结果

续表

表3 复方青梅饮料的正交试验结果

表4 工艺实验方差分析表

2.8 不同稳定剂对饮料的影响研究[11]参考文献记载，分别以浓度0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的CMC、海藻酸钠、卡拉胶、黄原胶、结冷胶分别取1 mL加入到100 mL混合提取液进行正交实验，放置于4 ℃的冰箱中7 d，观察沉淀产生情况。7 d作用后，发现卡拉胶、海藻酸钠、CMC三者在加入量为1%时能使混合提取液中的不稳定的蛋白等物质快速沉淀下来，而浓度为0.1%的CMC、卡拉胶、海藻酸钠、添加量为1%加入至混合提取液中，在4 ℃冰箱中放置7 d后，取上清液，即得饮料，该饮料口感较佳，色泽均匀澄清，具有原料特有的风味与香气，故此以浓度为0.1%的CMC、卡拉胶、海藻酸钠，加入量为1%添加入饮料的方式可达到预期目标。

2.9 复方青梅饮料的制备方法 将上述5种提取液混合，获得均匀一致的饮料，放置过夜，用200目纱布粗滤，得到澄清混合液，加入CMC、卡拉胶、海藻酸钠在4 ℃的冰箱中放置7 d，7 d后在5000 r·min-1的离心机下离心10 min，取上清液，加入0.1%苯甲酸钠，即可。

2.10 灭菌 将饮料密封，灭菌温度和时间如表5所示，放置于立式压力蒸汽灭菌机灭菌。结果表明：灭菌后，第2组口味最佳，故灭菌方法采用105 ℃条件下灭菌8 min。

表5 不用灭菌条件对复方饮料口味的影响

3 复方青梅饮料的质量研究

3.1 可溶性固体物含量测定 根据GB/T 12143《饮料通用分析方法》采用折光仪法测定：打开手持式折光仪盖板，用干净的纱或卷纸小心擦干棱镜玻璃面。在棱镜玻璃面上滴2滴蒸馏水，盖上盖板。于水平状态，旋动刻度调节螺旋，使分界线面刚好落在零线上。打开盖板，用纱布或卷纸将水擦干，如上法在棱镜玻璃面上滴2滴灭菌后复合汁进行观测，读取视野中明暗交界线上的刻度，即为成品中可溶性固形物含量(%)，重复三次。

分别测得可溶性固体含量为1.05%、0.95%、1.05%，取三次平均值即得复方饮料中可溶性固体含量为1.02%。

3.2 微生物检测

3.2.1 大肠菌群MPN值的测定 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(LST)肉汤，每管接种1 mL。并将接种管置于(36±1)℃培养箱中培养(48±2)h。结果均未出现气泡，说明该饮料中不存在大肠杆菌。

3.2.2 细菌总数检测(平板菌落计数法) 对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液加入两个无菌平皿内，同时取1 mL稀释液加入一个无菌平皿作为空白对照。及时将15 mL～20 mL冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并水平放置平板使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，(36±1) ℃培养(48±2)h。后用肉眼观察计数菌落[12]，每个平皿观察计数3次，最终结果该稀释度两个无菌平皿内菌落数平均值(即每个稀释度取六次观察结果之均值)。结果菌落总数为36 CFU/mL，未检出致病菌，达到安全级别。

3.3 饮料成分定性分析

3.3.1 标准品配制 精密称定2.500 mg没食子酸标准品，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成浓度为0.25 mg·mL-1的对照品储备液，摇匀，备用。精密称取2.500 mg橙皮苷标准品，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成浓度为0.25 mg·mL-1的对照品储备液，摇匀，备用。

3.3.2 供试品的配制 取配制好的复方青梅饮料500 mL，在旋转蒸发仪上浓缩成浸膏，用甲醇溶解并转移到50 mL的容量瓶中，定容，摇匀，备用。

3.3.3 色谱条件 色谱柱：Hypersil ODS 25 μm(4.6 mm×250 mm)，流动相：溶剂C(甲醇)和溶剂D(0.1%甲酸)，梯度洗脱：(0.01～8 min，C：8%→17%，D：95%→ 83%；8～15 min，C：17%→ 45%，D：83%→ 55%；15～25 min，C：45%～45%，D：55%～55%；25～27 min，C：45%～8%，D：55%～92%；27～37 min，C：8%～8%，D：92%～92%)，流速：1.00 ml·min-1，检测波长：283 nm，柱温：30 ℃，进样量：10 μL[13]。

3.3.4 色谱结果与分析 在所设的色谱条件下，没食子酸的保留时间为6.89 min，橙皮苷的保留时间为22.12 min，饮料中的没食子酸和橙皮苷能够有效分离，其他成分没有存在干扰。结果表明:复方青梅饮料中含有青果的主要成分没食子酸以及橘皮的主要成分橙皮苷。

4 讨论

随着现代中医药的发展以及人们对中医药更加广泛的认可，将食药两用的中药材进一步开发逐渐成为一种趋势。青果、乌梅等食药两用中药材在福建地区大量种植，产量高，但针对其本身附加值不高等问题，课题组在查阅文献的基础上发现青果具有防醉，解酒，保肝护肝、保护胃肠道黏膜、解豚鱼中毒、抗乙肝病毒、利咽止咳、抗菌等作用[14]，乌梅具有镇咳、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗惊厥、抑制黑色素、抑制肾结石形成、止血、抗氧化、抗病毒等作用[15]，明确了青果、乌梅具有利咽止咳功效，通过临床实践总结的青梅复方对因空调病造成的咳嗽口干，咽喉干燥等症状具有一定的治疗作用，将其开发为功能性饮料提升了青果、乌梅等中药材的附加值，同时也具有一定的经济效益和社会效益。

由于饮料制作应注意其风味口感，青梅复方中乌梅偏酸，因此期望调整成分比例在不影响其功效情况下达到较好的口感，故实验中采用正交试验方法对原料比例进行优化，最终确定最佳配方为:青果提取液24%，乌梅提取液3%，橘皮提取液14%，小米提取液10%，茶提取液8%，糖3%。同时根据前期研究结果表明该复方中含有大分子蛋白，不利于饮料的长期保存，因此通过文献研究，分别对CMC、海藻酸钠、卡拉胶、黄原胶、结冷胶进行考察，结果发现以CMC、海藻酸钠、卡拉胶做为稳定剂效果较好，由此组成复合添加剂：0.1%CMC、0.1%卡拉胶、0.1%海藻酸钠，加入量为1%。根据国家标准10789-2007《饮料通则》的规定，采取平板菌落计数法检测饮料中的固体含量以及微生物等，结果发现该饮料中不存在大肠杆菌，且细菌总数为36 CFU，达到安全级别。通过正交试验的方法得出的最佳配方比例，具有原料特有的风味、色泽鲜艳、均匀，以及后期以《饮料通则》为标准的一系列指标检测均符合国家之标准。

基于饮料主要成分青果、橘皮等经过沉淀、离心、高温消毒并在正交试验优化配方比例之后其主要成分的功能性成分是否存在的问题。课题组以青果、橘皮主要成分没食子酸和橙皮苷为检测对象，采用高效液相色谱法进行定性分析，结果在色谱图中可明显看出复方饮料中含有没食子酸以及橙皮苷。高效液相色谱法在测定饮料中是否存在没食子酸以及橙皮苷等主要成分时，具有灵敏度高、精确度高等优点，可根据图谱直观明了得出结论。但相对于定性分析常用的薄层色谱法以及化学反应等方法而言，高效液相色谱法更加复杂，可以以实际情况选择方法。

复方青梅饮料应用青果、乌梅、橘皮、小米、茶五种原料，经配伍，合理加工而得产品为色泽鲜艳、气味清新的绿色健康的功能性饮料。经过实验得出：青果的最佳提取工艺为1∶6的料液比，在55 ℃条件下水浴提取4 h；乌梅的最佳工艺为1∶6的料液比，在95 ℃条件下水浴提取30 min；橘皮的最佳工艺为1∶20的料液比，蒸煮15 min；小米的最佳工艺为1∶20的料液比，蒸煮30 min；茶的最佳提取工艺为1∶20的料液比，在90 ℃条件下水浴提取5 min。复方青梅饮料稳定剂为0.1% CMC、海藻酸钠、卡拉胶，添加量为1%。最佳配方为:青果提取液24%，乌梅提取液3%，橘皮提取液14%，小米提取液10%，茶提取液8%，糖3%，高温灭菌条件为105 ℃条件下灭菌8 min。以此做出的复方青梅饮料，工艺操作简单，在较低温度下即可提取，酸甜适中，均匀一致，具有青果，乌梅，橘皮的天然风味，可为开发中药保健饮料提供一定的参考价值。