牛琛皓 高霞

【摘 要】 Alport综合征（Alport syndrome，AS）是一种遗传性肾病， 是由编码α3、α4、α5（IV）胶原三聚体的COL4A3，COL4A4或COL4A5基因突变引起的。AS目前仍缺乏有效的治疗措施，故对AS早期确诊、治疗、延缓进展以及提供AS家系遗传学分析，减少遗传风险意义重大。随着二代测序技术的成熟与广泛应用，为尚未发现热点突变的AS患者基因测序及诊断提供了新方法。同时针对罕见病，建立生物样本库也是未来罕见病研究发展趋势。本文将重点介绍二代测序技术近年来在AS应用及诊断中的进展情况。

【关键词】 Alport综合征；COL4A3；COL4A4；COL4A5；二代测序技术；生物样本库

【中图分类号】

R969.4 【文献标志码】

A 【文章编号】1005-0019（2018）21-292-02

1 引言

Alport综合征（Alport syndrome，AS）是一种进行性的遗传性肾小球疾病，表现为镜下血尿或肉眼血尿，可伴有蛋白尿，聽力及视力下降，可进展至终末期肾病[1]，其发病率约为1/5000，在导致儿童慢性肾功能衰竭的病因中约占3.0%[3]。

AS是由编码α3、α4、α5（IV）胶原异源三聚体的COL4A3，COL4A4或COL4A5基因突变引起的遗传性疾病，其中α3、α4 基因突变所致为常染色体显性或隐性遗传，α5链基因突变所致为X染色体连锁的显性遗传[4-5]。COL4An（n为3、4或5）突变形式多种多样，尚未发现热点突变。目前报道显示突变类型以点突变，小的缺失最为常见，其他的有插入、重排等[6-7]。通过免疫荧光检查突变所致的Ⅳ型胶原链的异常可以诊断AS，但部分突变形成的异常Ⅳ型胶原链免疫荧光无法显示，此时就要从基因诊断方面研究。第二代测序（next-generation sequencing， NGS）技术的发展与成熟，为AS的基因诊断及AS患者基因突变筛查提供了新的方法。

2 AS目前的诊断方法（体系）

20世纪80年代，诊断AS多采用Flinter等提出的“四项诊断指标”，简便，但不能做到确诊，更没有遗传学提示。之后Gregory等提出AS诊断十条标准，全面但十分繁琐。再到目前的诊断方法：（1）肾活检电镜检查可见GBM出 现特异性的超微病理病变；（2）皮肤基底膜（IV）链表达异常，有些情况下还要结合肾组织基膜仅（IV）链的表达；（3）COL4An基因突变。

3 NGS技术特点及在AS中的应用价值

NGS技术特点：（1）高通量。可对芯片上数百万个点同时测序；（2）成本低。

NGS技术每Mb碱基成本比Sanger测序显著降低；（3）敏感性高，能保证对低丰度DNA信息的检测。

AS致病基因COL4A5（51个外显子）、COL4A3（52个外显子）和COL4A4（48个外显子），未发现突变热点，采用传统PCR方法测序费时费力成本高昂。提取患者皮肤标本培养成纤维细胞应用RT—RCR测序方法来检测COL4A5基因在某些无义突变介导的mRNA降解或外显子大片段缺失等情况下可导致突变检测失败。

而NGS技术可在同一张芯片上高特异性和高覆盖率捕获研究者感兴趣的目标外显子区域，从而筛选出突变。

4 目前报道的运用二代测序技术发现的突变位点

2017年一西班牙AS家系中，研究者应用NGS技术发现新发突变COL4A3基因外显子18中的p.G333E，外显子48中的Pro-Leu置换（p.P1461L），外显子49中的Ser-Cys替代（p.S1492C），以及COL4A3基因中p.G333E和p.P1461L或p.S1492C突变的携带者比仅携带p.G333E突变的携带者临床症状更加严重，发病更早。2017年中国一AS家系报道中发现COL4A5突变类型中无义突变和甘氨酸替代比其他错义突变临床表现更严重，COL4A5中由酸性氨基酸取代甘氨酸引起的临床表型更为严重。同年，意大利一AS家系报道中，研究者应用NGS技术发现发现c.2245-40A>G等位基因的X染色体灭活与杂合子女性中的疾病严重程度相关。使用常用生物信息分析软件结果趋向于杂合A→G这种氨基酸置换具有有害性。2016年研究人员在希腊家族性微血管畸形的研究中发现患有COL4A3/A4基因杂合突变的患者可能会被误诊为FSGS（局灶性节段性肾小球硬化）。发现新发突变COL4A5-p.C1567R，以及突变COL4A4-p.G748S，COL4A4-p.G774R和p.G1465D在两个不相关的家庭中具有普遍性。

5 利用NGS技术研究AS及慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）的潜力（建立AS及慢性肾脏病生物信息样本库）

生物样本库是一种应用于支持遗传研究的结构化资源，共有2种类型：（1）人口生物样本库（population—based biobank）；（2）疾病生物样本库（disease—oriented biobank）；建立CKD及AS患者生物信息样本库，可获得大量生物信息，加以处理分析得出生物信息学数据可运用在疾病的干预与管理。运用NGS技术可有针对性的选取所要研究的遗传性疾病的生物信息，快速建立对应疾病的生物信息样本库。

结语

AS是进行性、终生性的，尽早确诊有利于AS患者及家族成员得到有针对性的干预和治疗。NGS技术运用于AS的基因诊断是很有意义的，并且可便于区分TBMD（肾小球薄基底膜病）或AS，代表着未来AS的诊断方向。以NGS技术获取大数据为基础建立AS的生物信息样本库，将为今后AS的多领域研究提供数据支撑。

参考文献

[1] Levy M， Feingold J. Estimating prevalence in single-gene kidney diseases progressing to renal failure[J]. Kidney International， 2000， 58（3）：925-943.

[3] Barker D F， Hostikka S L， Zhou J， et al. Identification of mutations in the COL4A5 collagen gene in Alport syndrome[J]. Science， 1990， 248（4960）：1224-1227.

[4] Van Dijk E L，Auger H，Jaszczyszyn Y et a1.Ten years of next。generation sequencing technology[J].Trends Genet，014，30（9）：418-426.

[5] Shi J， Tong Y， Shen J G， et al. Effectiveness and safety of herbal medicines in the treatment of irritable bowel syndrome：A systematic review[J]. World Journal of Gastroenterology， 2008， 14（3）：454.

[6] Kawai S， Nomura S， Harano T， et al. The COL4A5 gene in Japanese Alport syndrome patients：spectrum of mutations of all exons. The Japanese Alport Network[J]. Kidney International， 1996， 49（3）：814-822.

[7] 丁浩， 郭顺华. 用PCT—SSCP方法检测中国人Alport综合征COL4A5基因突变[J]. 中华儿科杂志， 1999， 26（8）：473-476.