刘颖 刘凤兰

【摘 要】

目的：探讨无添加的黑枸杞酵素面膜抗衰老活性及安全性评价。方法：通过DPPH自由基清除试验、羟自由基清除试验考察抗氧化性能、MTT法检测成纤维细胞增殖、流式细胞术测定成纤维细胞凋亡率、家兔眼刺激试验进行整体评价。结果：抗氧化实验表明：黑枸杞酵素面膜具有很好的清除自由基作用，作用效果强于VE，且与剂量成正相关；细胞增殖实验表明：黑枸杞酵素面膜对成纤维细胞具有很好的增殖作用；流式细胞仪检测细胞凋亡率实验表明，培养24 h 的皮肤成纤维细胞凋亡率明显降低。结论：由酵素制备的黑枸杞无添加面膜可作为化妆品进行推广和使用。

【关键词】 黑枸杞；酵素；无添加；抗衰老

【中图分类号】R285.5

【文献标志码】A

【文章编号】1005-0019（2018）21-187-01

黑枸杞属于茄科枸杞属，生长环境使其具有极强的的耐寒、耐高温、耐干旱力，古医籍中具有益肾明目、补血宁神、生津止渴的功效，由于其含有丰富的微量元素、原花青素 、枸杞多糖 、甜菜碱、酸浆红素、胡萝卜素、维生素、亚油酸等，现代科学认为其可提高肌肤细胞抗氧化、抗衰老、保湿、抗过敏及抗炎等能力[1] 。是化妆品珍贵的原料之一。但在有限的工艺条件下，其提取出的护肤活性成分含量较低。而采用生物发酵技术，过程中基质金属蛋白酶的活性受到抑制，可降低其对胶原蛋白的裂解，从而能更好地保持黑枸杞的营养成分。

本试验使用的即为采用生物发酵技术工艺制备的黑枸杞面膜，同时添加了具有抗衰老成分的银耳、人参等成分，制備过程中坚守天然无添加的原则，从而既保证了有效成分高提取率，高吸收率，又可防止防腐剂对机体造成的内分泌紊乱、神经系统伤害及产生的皮肤的过敏等毒性作用。以期为现代所倡导的绿色高科技的无添加化妆品制备提供理论依据。

1 实验材料和方法

1.1 供试品 洋妈制嫩肤葆颜水润鲜膜，由厦门洋妈制生物科技有限公司制备。

1.2 实验方法

1.2.1 抗氧化试验

1.2.1.1 DPPH自由基清除试验 参考文献[2]，称取适量DPPH，用无水乙醇配制DPPH 溶液。将面膜液以85%的乙醇进行等比稀释，稀释后相当于质量浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2g/L的待测液，加入至96孔板中，另设空白对照组和维生素E阳性对照组，再加入 150 μL 浓度为 0.1 mmol/L 的 DPPH 溶液，混合均匀，避光反应 30 min，517 nm 波长处，测定吸光度A 值，计算清除率。

1.2.1.2 羟基自由基清除试验 将面膜提液以85%的乙醇进行等比稀释，稀释后相当于质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0g/L的待测液，参照文献[3]，在比色管中依次加入2.0 mL 9.0mmol/L的FeSO 4溶液、待测样品和2.0 mL8.8mmol/L的过氧化氢溶液，混匀，静置10 min，再加入 2.0 mL 6.0 mmol/L的水杨酸乙醇溶液，振荡器上混匀，置于37℃水浴锅中，20 min后，离心8min，取上清液测定吸光度（A536nm），所得值为A1；设蒸馏水空白组，测得吸光度为A0；阴性组吸光度记A2。羟基自由基清除率计算公式为：（A1-A0） /（A2-A0） ×100%。另设维生素E为阳性对照组进行测定。

1.2.2 成纤维细胞增殖实验

1.2.2.1 细胞培养 组织块贴壁法[4]体外培养人皮肤成纤维细胞，用4-6代处于对数成长期细胞。

1.2.2.2 供试品处理 精密称取面膜液（无添加和添加防腐剂）各1ml，相当于含有原料药为0.1克，临用时用含80ml/L的PBS的DMEM倍比稀释成不同浓度的面膜稀释液。使成浓度为50μg /ml、100μg /ml、200μg /ml的三个剂量组。

1.2.2.3 实验分组 分为7组：空白组；低、中、高供试品组；低、中、高加入防腐剂供试品组。

1.2.2.4 MTT法检测体外培养成纤维细胞的增殖 取胰酶消化培养的细胞，调整细胞浓度，分别加入以上6个供试品溶液，置于96孔板，同时设不加药物的空白对照组。每个质量浓度及空白组设4个复孔，另做 1 孔不加细胞 ，只加培养液和中药（比色时用此孔调零）。培养 24小时后取出，490nm下测定吸光值。

1.2.3 流式细胞仪检测成纤维细胞凋亡率 细胞分为两组，酵素面膜组，剂量为300μg /ml，另一组为相应浓度的 DMSO（0. 01 %）作溶剂的对照组，将细胞接种于 6 孔板中，CO2 培养箱中培养 24 h 后，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 家兔眼睛刺激试验 取实验动物兔4只，雌性，健康状态下进行试验，轻拉开单侧眼下眼睑，取供试品0.1ml滴入结膜囊中，分别观察12、24、48、72、96h及第7天的眼部反应，按照化妆品的安全性评价程序规定的评分标准进行权重评级。

2 实验结果

2.1 抗氧化实验结果

2.1.1 黑枸杞酵素面膜对DPPH具有很好的清除作用，且作用效果强于VE，且与剂量成正相关，当浓度达到3.2g/L时，清除率可达67.5%。结果见图1。

2.1.2 由实验结果可知，黑枸杞酵素面膜对羟自由基具有很好的清除作用，且作用效果强于VE，且与剂量成正相关，当浓度达到8.0g/L时，清除率可达68.3%。结果见图2。

2.2 MTT细胞增殖实验结果 细胞增殖实验表明，黑枸杞酵素面膜对成纤维细胞具有很好的增殖作用，与添加防腐剂的进行对比，其效果优于添加剂组，结果见图3。

2.3 流式细胞仪细胞凋亡试验结果 通过流式细胞仪检测细胞凋亡率实验 ，结果表明，培养24 h 的皮肤成纤维细胞凋亡率明显降低，已由 49.9%下降到26.3 %（P <0.01） ，结果见表1.

2.4 安全性试验结果 家兔眼刺激试验结果表明，受试家兔眼睛7天内指标均为正常。根据“国家食品药品监督管理局化妆品规定眼刺激性评价标准”，评价结果为无刺激性。

3 讨论

酵素含有丰富的酶，人体肌肤中的酵素能促进表皮细胞的新陈代谢，促进真皮纤维的再生，起到清洁皮肤，去除油脂消除青春痘，淡化皱纹，改善肌肤状况，使皮肤紧实细致，年龄增长导致体内酵素的减少，也是皮肤衰老的主要原因之一。因此将现代生物技术制备的酵素加入到美容产品中，可以起到加强肌肤的健康，延缓皮肤衰老的作用[5]，酵素已然成为一类新兴的化妆品功效添加剂。

目前评价抗氧化的方法有ABST、DPPH试验、超氧阴离子实验、羟自由基实验、脂质过氧化抑制试验、还原能力的测定[6]，其中DPPH是天然产物抗氧化能力最常使用的一种评价方法[7]；羟自由基由于可以使氨基酸、核酸等多种物质发生氧化反应[8]而成为活性很强的自由基，本实验采用这两种经典方法对其抗氧化能力进行评定，试验结果初步证明了其具有较强的抗氧化能力，且随剂量增加而增加；成纤维细胞是皱纹形成过程中发挥主要作用的细胞，衰老的主要表现为：增殖能力降低和细胞凋亡率的明显增加[9]，本试验采用MTT和流式细胞术对这两种指标进行检测，真实的反映了供试品对成纤维细胞的生物学特性改变，为本面膜的效果做出了有价值的评定，其中MTT法对无添加和有添加做了比较，无添加产品效果明显好于添加产品，说明了化学类的防腐剂对细胞的增殖具有一定的抑制作用，在有效成分的配合使用下方显出一定效果，间接证明了它对皮肤或机体具有一定的副作用，使用本产品的无添加形式具有一定的安全性优势，对于孕产妇妇女优越性更是可观，安全性评价符合严格的标准化规定，如前所述，酵素不仅具有很好的抗衰老、改变皮肤状况作用，而且对于处方中药物成分的提取和促进皮肤的吸收以至于防腐都有一定的效果，其在国外已经普及使用，但在我国还处于起步阶段，随着人们对化妆品绿色、安全、高科技的青睐，本实验用化妆品具有广阔的开发前景。

参考文献

[1] 林丽，张裴斯，晋玲，等.黑果枸杞的研究进展[J].中国药房，2013，24（17）：4493-4497.

[2] 孙丽萍，王大仟，张智武.11 种天然植物提取物对 DPPH 自由基的清除作用[J].食品科技，2009，30（1）：45 -47.

[3] Zhang Zuofa，Lv Guoying，He Weiqiang，et al.Effects of extractionmethods on the antioxidant activities of polysaccharides obtained from Flammulina velutipes [J].Carbohydrate Polymers，2013，98 （2）：1524-1531.

[4] 王林林，张健等.优化贴壁法人皮肤成纤维细胞的原代培养[J]南京医科大学学报自然科学版，2014，34（1）：124-126.

[5] 董银卯，何聪芬，王领，等.火龙果酵素生物活性的初步研究[J].食品科技，2009（34）：192-196.

[6] 曾维才，石碧，天然产物抗氧化活性的常见评价方法[J]，化工进展，2013，32（6）：1205-1211

[7] Sharma O P，BhatPK，DPPH aotinxidant assay revisited[J]，food Chemistry，2009，113（4）：1202-1205.

[8] 郭雪峰，岳永德等.用清除羥自由基法评价竹叶提取物抗氧化能力[J].光谱学与光谱分析，2010，30（2）：508 -511.

[9] Gentile M，Latonen L，Laiho M，et al.Cell cycle arrest and ap Optosis provoked by UV radiation-induced DNA damage are transcriptionally highly divergent responses. Nucleic Acids Res，2003，31：4779-4790.