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(海南大学食品学院,海南海口 570100)

牛肉的宰后嫩化受到许多复杂机制和因素的影响,近年来,越来越多的研究集中在细胞凋亡对肉嫩度的影响上[1],特别是内源性蛋白水解酶(如钙蛋白酶,组织蛋白酶和半胱天冬酶等)对肌纤维蛋白的水解作用[2]。Sentandreu等[3]首先提出了,凋亡酶系(Caspase家族酶)在宰后成熟过程中参与蛋白水解和肉的嫩化。随着肉类科学的发展,许多证据表明,在肌肉嫩化过程中,凋亡对关键肌原纤维蛋白的水解发挥着重要作用[4-6]。

Bcl-2蛋白质家族是细胞凋亡过程中一类重要的调节因子,主要通过家族成员间相互作用引发线粒体外膜通透(mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP),促使细胞凋亡。细胞凋亡(Apoptosis)主要通过两种途径发生,死亡受体途径和线粒体途径[7]。Bax与Bcl-2在线粒体膜上形成异源二聚体,改变线粒体膜通透性[8],促凋亡蛋白细胞色素-C(Cyt-C)被释放至细胞质后,引发Caspase级联反应,促进细胞凋亡。Cyt-C一旦释放到细胞质中,将与凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)的dATP介导的寡聚化结合,以激活前Caspase-9,并激活Caspase-3,其最终激活凋亡级联反应,这是线粒体途径。死亡受体途径是指Caspase-8在线粒体膜上与死亡结构域DED结合形成复合物,Caspase-8酶原片段发生自我剪切,激活Caspase-3,导致细胞凋亡[9]。

牛肉的嫩度是评价其品质的关键指标,影响消费者的购买决定。研究表明,细胞凋亡对肉的嫰化起主要作用,但凋亡过程如何被激活却鲜有报道。本研究测定了牛肉宰后成熟过程中抗凋亡蛋白(Bcl-2)、促凋亡蛋白(Bax)和细胞凋亡酶Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等表达量以及不同部位牛肉剪切力值,旨在探究Bcl-2蛋白介导Caspases级联反应对牛肉凋亡的调控机制,以丰富牛肉宰后嫰化理论和指导企业对牛肉的生产加工。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛肉样品 选择10头12～18月龄的海南省五指山小黄牛,取其前躯肱三头肌(TB)、中躯背最长肌(ML)、后躯半膜肌(SM)作为实验样品;Bicinchoninic Acid Protein试剂盒和DBA试剂盒 海南怡创科技有限公司;缓冲液A、HEPES和蛋白酶测定缓冲液 上海默悉生物科技有限公司;羊抗兔免疫球蛋白(Goat Anti-Rabbit IgG)、Bcl-2抗体、Bax抗体、Anti-Cytochrome C(抗细胞色素C)、Anti-Caspase-3(抗caspase-3)、Anti-Caspase-8(抗caspase-8)、Anti-Caspase-9(抗caspase-9)和Rabbit anti GAPDH(兔抗GAPDH) 上海浩洋生物科技有限公司;TBST(洗涤缓冲液)、CHAPS(3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸钠盐) 北京索莱宝科技有限公司。

LM4型嫩度仪 北京天翔飞域仪器设备有限公司;WFH-101B凝胶成像分析系统 上海精科实业有限公司;DNM-9606酶标分析仪 北京普朗新技术有限公司;RDY-600A电泳仪电源 北京荣阳经典科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肉样预处理 将肉样置于0～4 ℃条件下进行成熟,在熟化的第2、6、12、24、48、96、168 h,分别从TB、ML、SM三个部位取适量肉样,用于Bcl-2家族蛋白、Cyt-C、Caspase家族酶、Caspases活力和剪切力的测定。

1.2.2 线粒体的分离 参考Li等[10]方法,分别取TB、ML和SM部位肉样各20 g,切成碎屑,加入缓冲液A(70 mmol/L蔗糖,220 mmol/L甘露醇,2.0 mmol/L乙二胺四乙酸,5.0 mmol/L 4-吗啉丙磺酸和0.5%牛血清白蛋白(BSA);pH7.4)(重量:体积=1/10),在4 ℃、1000 r/min下离心10 min,取上清液再次在4 ℃、1000×g下离心10 min。随后,在上清液中加入适量缓冲液B(稀释7.5倍不含BSA的缓冲液A),在80 ℃、8000 r/min下离心20 min,得到线粒体(沉淀)和细胞溶质(上清液)。并将所得的线粒体沉淀物悬浮于100 mL缓冲液B中。

1.2.3 SDS-PAGE结合免疫印迹分析测定蛋白表达量 参考李晶晶[11]的方法,采用分离胶浓度12%,浓缩胶浓度5%对线粒体蛋白和细胞溶质蛋白进行电泳。电泳分离后用半干转膜仪将凝胶中的蛋白转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,转印后的PVDF膜用含5%脱脂奶粉的TTBS溶液(0.05% Tween 20,50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl,pH7.5)25 ℃封闭1 h,再用TTBS溶液漂洗,再与用含5%脱脂奶的TTBS溶液1∶500稀释的Bcl-2抗体、Bax抗体、抗细胞色素C、抗Caspase-3、抗Caspase-8、抗Caspase-9和兔抗GAPDH在4 ℃下分别反应12 h,GAPDH作为内参抗体。TTBS溶液洗去多余抗体之后,与相对应的二抗(1∶1000稀释的过氧化物标记Goat Anti-Rabbit IgG)抗体在25 ℃条件下孵育1 h,TTBS浸洗后,用DBA试剂盒显色,根据条带分子量计算Bcl-2、Bax、Cyt-C和Caspase家族酶的表达量。

1.2.4 Caspases酶活力测定 参考Huang等[12]方法,分别取TB、ML、SM各200 mg,加入0.5 mL 100 mmol/L HEPES(10%蔗糖,0.1% NP-40,10 mmol/L二硫苏糖醇,pH7.5)对肉样进行裂解,在冰上粉碎并进行三次冻融循环(在-20 ℃下冰冻1 h,在4 ℃下融化3 h)。18000×g离心30 min后,取20 μL上清液至0.2 mL蛋白酶测定缓冲液(10% 蔗糖,0.1% CHAPS,100 mmol/L HEPES,pH7.5)中,然后加入5 μL重建荧光底物Ac-DEVD-AMV、AV-IETD-AMC和Ac-LEHD-AMC(分别用于Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9),混合物在37 ℃下孵育1 h。将反应液置于96孔板的酶标仪中,37 ℃条件下孵化1 h,然后分别于360 nm和460 nm的激发和发射波长下读取荧光强度。使用Bicinchoninic Acid Protein试剂盒,测定上清液的蛋白质含量,酶活力单位用每min,每mg肉样的相对荧光强度表示。

1.2.5 剪切力测定 参考Wiklund等[13]的方法,分别取TB、ML、SM样品30 g进行蒸煮,待中心温度达到75 ℃时取出样品冷却至室温,沿肌纤维方向取3～5个直径为1.5 cm的肉柱,用嫩度仪沿肌纤维垂直方向切断肉柱,记录剪切力值。

1.2.6 图像获取与分析 使用凝胶成像系统获取凝胶图像,Quantity One分析软件进行轨迹定量分析,计算目的条带的光密度值。

1.2.7 统计分析 每组试验做3次重复实验,数据处理用SPSS 19.0分析软件,用Duncan法进行多重比较,图形制作用Origin 8.0作图软件。显著水平α=0.05,采用标记字母法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 宰后牛肉成熟过程中Bcl-2、Bax蛋白表达

Bcl-2属于Bcl-2家族蛋白中的保护者,大多位于线粒体膜上,属于抗凋亡蛋白;Bax属于效应者,生理状态下以未活化的单体存在于细胞质基质中,受到凋亡信号后构象改变,易位到线粒体外模并被激活,活化后的Bax相互作用,形成多聚体致使线粒体外模通透,诱发细胞凋亡,从而改善肉的嫩度[14]。由图1和图2可知,宰后成熟过程中检测到Bax和Bcl-2,在宰后168 h内,不同部位牛肉中Bax/Bcl-2相对含量呈上升趋势,宰后2～168 h,TB、ML和SM中的Bax/Bcl-2相对含量均显著升高(p<0.05)。

图1 宰后牛肉成熟过程中Bax和Bcl-2蛋白免疫印迹表达Fig.1 The immunoblot of Bax and Bcl-2 proteins during the post-mortem beef maturation

图2 宰后牛肉成熟过程中Bax/Bcl-2相对含量变化Fig.2 The relative content of Bax/Bcl-2 during the maturation of post-mortem beef注:图中小写字母表示差异显著(p<0.05),图4、图6同。

Bax与Bcl-2之间的平衡决定细胞凋亡程度,Bax表达量过高可激活凋亡过程[15]。宰后成熟过程可促进Bax/Bcl-2比例的增加,在宰后12～24 h,TB、ML和SM中的bax/Bcl-2相对含量显著升高(p<0.05)。Bcl-2可通过直接镇压VDAC或异二聚化促凋亡Bcl-2家族成员,阻止线粒体膜通透性的扩增。Bax激活后会转移到线粒体中,然后插入细胞外膜并低聚形成大通道[16]。上述发现进一步表明,氧化应激可影响Bcl-2家族蛋白的表达和线粒体途径。然而,Bcl-2家族中其他蛋白对牛肉线粒体凋亡途径中的调控机制仍需进一步探究。

2.2 宰后牛肉成熟过程中胞浆Cyt-C蛋白表达

Cyt-C是调控细胞凋亡的重要蛋白质,存在于线粒体内膜。Cyt-C进入细胞质后会引起Caspase级联反应,水解肌纤维蛋白。由图3和图4可得,宰后成熟过程中在TB、ML和SM中均检测到Cyt-C,在宰后168 h内,不同部位牛肉中胞浆Cyt-C相对含量呈升高趋势,宰后12～24 h升高极显著(p<0.01)。

图3 宰后牛肉成熟过程中Cyt-C免疫印迹表达(主要条带用箭头表示)Fig.3 Cyt-C immunoblot expression during maturation of post-slaughter beef(the main bands indicated by arrows)

图4 宰后牛肉成熟过程中胞浆Cyt-C相对含量变化Fig.4 The change of cytosolic Cyt-C content during the maturation of post-slaughter beef

有关研究表明,细胞凋亡过程中,Cyt-C从线粒体释放到细胞质的过程对Caspase的激活具有至关重要的作用[17]。因此,研究了宰后成熟过程TB、ML和SM中Cyt-C的释放。为探究Cyt-C从线粒体到细胞质中的释放过程,用Western印迹分析对细胞质中Cyt-C进行检测。结果表明,宰后成熟过程中,Cyt-C的含量显著增加(p<0.05),在12～24 h快速上升,这可能是因为,在宰后12～24 h,Bax/Bcl-2相对含量增加,从而引发凋亡的线粒体途径。Bcl-2家族蛋白水平的改变引发MOMP,Cyt-C的释放启动细胞凋亡[18-19]。

2.3 宰后牛肉成熟过程中胞浆中Caspase蛋白表达

Caspases级联反应被激活后,上游起始酶Caspase-8、Caspase-9自我剪切为有活性的18、23 kDa片段,激活下游效应酶caspase-3剪切为17 kDa活性片段,水解肌原纤维蛋白,最终导致不可逆的细胞凋亡[11,14,20]。本研究通过SDS-PAGE和蛋白质印迹对Caspases进行免疫印迹分析,17、18和23 kDa分别代表Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性片段。图6表明,在2～12 h宰后牛肉中,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活化片段蛋白含量显著升高(p<0.01),12～24 h显著降低(p<0.05),随后变化趋于平稳,宰后12～24 h,ML的活化片段含量均显著高于TB和SM(p<0.05)。

图5 宰后牛肉成熟过程中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白免疫印迹表达(主要条带用箭头表示)Fig.5 Western blotting of Caspase-3,Caspase-8, and Caspase-9 proteins during maturation of post-mortem beef(the main bands indicated by arrows)

图6 宰后牛肉成熟过程中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9相对含量变化Fig.6 The relative contents of Caspase-3,Caspase-8,and Caspase-9 during the maturation of post-slaughter beef

2.4 宰后牛肉成熟过程中Caspase活力变化

宰后成熟过程中,不同部位牛肉Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活力如图7所示,Caspase活力均呈先增后减的趋势。在2～12 h,不同肌肉Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活力显著上升(p<0.01),最大活力值大多在在宰后12 h,ML中Caspase-3最大活力出现在宰后24 h。结果表明,在宰后成熟过程中会引发Caspase级联反应,且ML中Caspase-8、Caspase-9的激活发生在Caspase-3之前。

图7 宰后牛肉成熟过程中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9酶活力变化Fig.7 Changes of Caspase-3,Caspase-8 and Caspase-9 enzyme activitiesduring maturation of post-mortem

在宰后成熟过程中,牛肌肉中Caspase-9和Caspase-3活性的显着变化符合Krammer P H[21]的报告,他们也指出,宰后环境诱导Caspase-9的活化,Caspase-9通过牛肌肉内在途径激活Caspase-3。本研究还发现,宰后12～24 h,Caspase-8、Caspase-9活力显著增加(p<0.05),而Caspase-3极显著增加(p<0.01),这可能是因为宰后成熟过程中,Caspase-8的活化启动死亡受体途径,激活Caspase-3。因此,宰后成熟过程中,牛肉细胞凋亡是线粒体途径和死亡受体途径综合作用的结果。

2.5 宰后牦牛肉成熟过程中剪切力的变化

剪切力在一定程度上反映肉的嫩度,剪切力越小,肉质越嫩。由图8可知,宰后不同部位牦牛肉的剪切力值呈下降趋势,宰后6～48 h,剪切力值下降极显著(p<0.01),随后变化不显著。宰后12～168 h,ML的剪切力显著低于TB和SM。结果表明,在宰后6～48 h,牛肉嫩度极显著提高(p<0.01),且ML嫩度优于TB和SM。

图8 宰后牛肉成熟过程中剪切力值的变化Fig.8 The shear force change in yak meat during postmortem aging

剪切力是一个重要且广泛使用的指标,用于评价宰后成熟过程中肉的嫩化程度[22]。本研究指出,在宰后12～24 h,随着不同部位牛肉Bax/Bcl-2相对含量显著升高(p<0.05),Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活力显著增加(p<0.05),剪切力值显著下降(p<0.05),宰后12～168 h,ML的剪切力显著低于TB和SM(p<0.05)。结果表明,宰后成熟过程中不同部位牛肉Bax/Bcl-2相对含量升高启动Caspases级联反应,水解肌原纤维蛋白引发细胞凋亡,从而提高肉的嫩度。

3 结论

结果显示,在宰后12～24 h,在宰后2～12 h,TB、ML和SM的Bax/Bcl-2相对含量和Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活力均显著上升(p<0.05),宰后6～48 h,剪切力值显著下降(p<0.01)。牛肉宰后嫩化依赖于线粒体途径和死亡受体途径,Bcl-2蛋白通过介导Caspases级联反应,对牛肉嫩度进行调控。不同部位牛肉Bax/Bcl-2相对含量的升高导致Cyt-C从线粒体释放到细胞质,启动Caspase级联反应,激活Caspase-3水解肌原纤维蛋白,引发细胞凋亡,且ML中Caspase-8、Caspase-9的激活发生在Caspase-3之前,最终导致在宰后48 h内牛肉嫩度不断提高,且ML嫩度优于TB和SM。本研究丰富了牛肉宰后嫰化理论,对于指导企业对牛肉的生产加工具有重要现实意义。