吴 慧，崔本来

（1.商丘学院 风景园林学院，河南 商丘 476113；2.商丘学院 体育学院，河南 商丘 476113）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种多功能分子，对人体有多种生理功能，如增进脑活力、营养神经细胞、增加生长激素分泌、健肝利肾等[1-3]，而运动型饮料中也会添加此种物质来增加其产品的功效和卖点。运动型饮料是一种根据人体运动生理特点而配制的饮品，能补充人体运动后或者疲劳时所需的营养物质[4-5]，因其是针对特殊人群饮用的一种饮品，具有一定的特殊性，对食品的安全性要求高，所以更需要对这类产品中GABA的添加情况进行检测和监控。

目前γ-氨基丁酸的检测方法主要有薄层色谱（thin-layer chromatography，TLC）法、毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）法、氨基酸分析仪法和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法等[6-10]。其中纸层析法的精准度较低，毛细管电泳法实验操作的过程较复杂，氨基酸自动分析法的分析仪器价格较昂贵，而高效液相色谱法因准确、高效而被广泛应用。因GABA本身对紫外光吸收小，一般需要衍生化后才能使用紫外检测器检测[11]。目前常用的衍生试剂有苯二醛-2-巯基乙醇、丹磺酰氯以及邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）等[12-15]，其中OPA具有价格便宜、衍生时间短、简单易操作等优点，作为一般实验选用的衍生试剂。但OPA的衍生产物不稳定、衍生后需快速进样[16]，故本研究采用在线柱前自动化衍生装置，对测定GABA的色谱条件、衍生条件及运动饮品的前处理条件进行优化，旨在建立一套系统性的在线柱前衍生-高效液相色谱分析运动型饮料中γ-氨基丁酸含量的方法，为运动型饮料中γ-氨基丁酸的分析和监控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

运动型饮料：随机购买于超市中，标称为运动型饮料的样品。

1.1.2 试剂

γ-氨基丁酸标准品（纯度99.9%）：国家标准物质中心；邻苯二甲醛、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

2695型高效液相色谱、2998型二极管阵列检测器（diode array detector，DAD）、Waterssunfire C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）：美国Waters公司；Thermo hypersil gold C18柱（4.6mm×250 mm，5μm）：美国Thermo公司；Agilent Zorbax SBAQ柱（4.6mm×250mm，5μm）：美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件的优化

采用高效液相色谱仪串联二极管阵列检测器对GABA进行检测，分别对色谱柱种类（Waterssunfire C18柱、Thermo hypersil gold C18柱、Agilent Zorbax SBAQ柱）[17-18]、流动相种类（20mmol/L磷酸缓冲溶液-甲醇、20mmol/L乙酸钠-乙腈）[19-20]以及检测波长（190～450 nm）3个色谱条件进行优化。其中流动相梯度洗脱程序Ⅰ：A（20mmol/L磷酸缓冲溶液）-B（甲醇）为B 30%、0～5.0 min，B 30%～50%、5.0～12.0 min，B 50%～30%、12.0～15.0 min；流动相梯度洗脱程序Ⅱ：A（20mmol/L乙酸钠）-B（乙腈）为B 30%、0～5.0min，B 30%～50%、5.0～12.0min，B 50%～30%、12.0～15.0min；流动相等度洗脱程序Ⅲ：A（20mmol/L乙酸钠）-B（乙腈）为70∶30（V/V）。

其余色谱条件为流速：1.0 mL/min；进样量：20μL；柱温：30℃。

1.3.2 柱前衍生条件的优化

衍生试剂的制备：称取0.1 g OPA，用1 mL乙腈溶解，加100μL巯基乙醇，用0.5mol/L的硼酸缓冲液定容至10mL，过0.22μm滤膜，4℃可保存1周。

OPA柱前衍生化具有高度灵敏性，但衍生产物不稳定，因此，本试验选取不同衍生时间（0.5 min、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min）和不同衍生温度（40 ℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃），采用在线柱前衍生装置对50μg/mL的GABA标准品进行衍生，初始衍生温度为40℃，考察衍生时间及温度对目标物组分峰面积的影响。

具体步骤：准确称取5.0mL样品，加入乙腈溶液5mL超声提取10min，然后将提取液在3000r/min条件下离心10min，吸取上清液待用。取标准品液或者样品上清液与衍生试剂在线混匀，分别分析衍生反应时间以及衍生反应温度对GABA峰面积的影响。

1.3.3 GABA标准曲线的绘制

分别称取一定质量的GABA标准品，配制成质量浓度为1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL的标准溶液，采用在线柱前衍生装置与衍生试剂OPA衍生后分析，以GABA质量浓度（x）为横坐标，GABA峰面积（y）为纵坐标绘制GABA标准曲线。

1.3.4 萃取溶剂的选择优化

运动型饮料中γ-氨基丁酸的提取，一般选用萃取溶剂进行萃取。本实验分别比较了4种不同的萃取溶剂（乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯）对GABA的萃取率的影响[21-23]。以已知GABA含量的运动型饮料为基质，加入50μg/mL的GABA标准品，比较萃取率，萃取步骤见1.3.2，选择较优的萃取剂进行样品的前处理。萃取率计算公式如下：

式中：y为萃取率，%；x为萃取后样品中的目标物的含量，μg/mL；xo为原样品中目标物的含量，μg/mL；a为样品中加入的目标物的含量，μg/mL。

1.3.5 回收率与精密度的测定

以已知GABA含量的运动型饮料为基质，加入不同质量浓度（5.0 mg/L、10.0 mg/L、50.0 mg/L）的GABA标准液，选择优化后的前处理条件操作，上机检测，计算回收率及相对标准偏差（relativestandard deviation，RSD），每个质量浓度重复测定5次。回收率计算公式如下：

式中：Y为回收率，%；X为加标后样品中的GABA的含量，mg/L；XO为已知运动饮料中GABA的含量，mg/L；A为样品中加入的GABA的含量，mg/L。

1.3.6 样品的检测

在市场上随机抽取5种运动型饮料，采用最优的检测条件测定样品中GABA的含量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

不同色谱柱对GABA检测的影响结果见图1。

图1 3种色谱柱条件下GABA的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms ofγ-aminobutyric acid using 3 kinds of chromatographic columns

由图1可知，GABA在Waterssunfire C18柱中基线稳定，峰形较对称，在其他两种色谱柱中基线漂移、峰形响应值不高，所以采用Waterssunfire C18柱对GABA进行色谱分析。

2.1.2 流动相的确定

GABA的柱前衍生物分离一般采用磷酸缓冲溶液-甲醇或者乙酸钠-乙腈为流动相，不同流动相对GABA标准品检测的影响结果见图2。

图2 GABA标准品的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms ofγ-aminobutyric acid standard

由图2可知，磷酸缓冲溶液-甲醇或者乙酸钠-乙腈为流动相，梯度洗脱时，洗脱的时间较长且基线不稳。而以20 mmol/L的乙酸钠溶液-乙腈（体积比70∶30）为流动相等度洗脱时，GABA标准品的HPLC色谱图基线稳定且响应值最大，12 min内GABA能达到有效地分离。因此，最适流动相为20 mmol/L的乙酸钠溶液-乙腈（体积比70∶30）等度洗脱。

2.1.3 检测波长的选择

为了提高方法的灵敏度，选择合适的检测波长，采用二极管阵列检测器在检测波长190～450 nm范围内对GABA标准品进行全波长扫描。DAD的检测波长对GABA标准品检测效果的影响见图3。

图3 GABA的全波长扫描图Fig.3 Full wavelength scan ofγ-aminobutyric acid

由图3可知，γ-氨基丁酸衍生物的特征吸收波长有3处，其中216 nm处为最大吸收波长，但此波长处干扰峰较多。为了确保目标组分既要有最大的吸收值，又要避免基质的噪音干扰。综合考虑，选取波长247nm为GABA的检测波长。

2.2 柱前衍生条件的优化

2.2.1 衍生时间的影响

柱前衍生时间对GABA标准品峰面积的影响结果见图4。

图4 衍生时间对GABA峰面积的影响Fig.4 Effect of derivatization time on the peak area of γ-aminobutyric acid

由图4可知，衍生反应时间在2 min左右时，GABA标准品的峰面积达到42，再延长衍生时间，GABA的稳定性变差，峰面积变小，由于GABA的峰面积与其测定含量为正相关，所以选择2 min作为衍生反应的时间。

2.2.2 衍生温度的影响

设定OPA柱前衍生化反应的时间为2min，衍生温度对GABA标准品峰面积的影响结果见图5。

图5 衍生温度对GABA峰面积的影响Fig.5 Effect of derivatization temperature on the peak area of γ-aminobutyric acid

由图5可知，随着衍生温度的升高，GABA的峰面积呈现先增大后减少的趋势，由400增大到525。当衍生温度在45℃左右时，衍生物的峰面积趋于稳定，峰面积在500左右，相差不大；当衍生温度＞60℃之后，衍生物不稳定，GABA峰面积急剧下降至350，所以选择45℃作为衍生温度。

2.3 GABA标准曲线的绘制

以GABA含量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制GABA标准曲线见图6。

由图6可知，GABA质量浓度在1.0～100.0μg/mL范围内具有良好的线性关系，R2为0.998 6，其检出限为0.30 mg/kg，定量限为1.0 mg/kg。

图6 γ-氨基丁酸的标准曲线Fig.6 Standard curve ofγ-aminobutyric acid

2.4 萃取溶剂优化

不同萃取溶剂对运动型饮品中GABA萃取率的影响结果见图7。

图7 萃取溶剂对GABA萃取率的影响Fig.7 Effect of extraction solvent on the extraction rate of γ-aminobutyric acid

由图7可知，由于运动型饮品中营养元素较多，丙酮作为萃取剂，混合、离心后样品溶液浑浊，乙酸乙酯为萃取剂对GABA的萃取率仅有37%，只有乙醇和乙腈萃取GABA较完全，萃取率能达到74.5%和86.7%，但是乙醇与饮品分层不明显。因此，选择乙腈为萃取溶剂。

2.5 加标回收率与精密度

以未添加γ-氨基丁酸的运动型饮料为基质，分别添加不同质量浓度的标准溶液后进行加标回收率试验，测定结果见表1。

表1 方法的加标回收率及相对标准偏差的测定结果（n=5）Table 1 Determination results of the adding standard recovery rate and RSD of the method(n=5)

由表1可见，加标回收率为82.5%～90.6%，相对标准偏差（RSD）为2.9%～3.7%，表明本实验所建立的方法能够满足检测实际样品需要。

2.6 运动型饮料样品的测定

5种运动型饮料中GABA的检测结果见表2。

表2 5种运动型饮料样品中GABA含量的测定Table 2 Determination of GABA content in 5 kinds of sports drinks samples

由表2可知，5种运动型饮品中都添加了GABA，含量范围为0.32～16.38 mg/100 mL，整体与产品外包装标签中标出的一致，但是不同品牌之间GABA的含量具有明显差异（P＜0.05）。消费者在目标性地选用含有此物质的运动饮料时，还是应进行比较，这样会达到更有效的补充目的。

3 结论

本实验通过优化HPLC条件、在线柱前衍生条件及萃取条件建立了一种在线柱前衍生-高效液相色谱法检测运动型饮料中γ-氨基丁酸的分析方法。结果表明，色谱条件：Waters sunfire C18色谱柱，20 mmol/L的乙酸钠溶液-乙腈（体积比70∶30）作为流动相，二极管阵列检测器的检测波长247 nm，柱温30℃，流速1.0 mL/min，进样量20μL；在线柱前衍生条件：OPA为衍生剂，柱前衍生时间2.0 min，衍生温度45℃。在最优检测条件下，GABA在1.0～100.0μg/mL质量浓度范围内均具有良好的线性关系（R2=0.9986），检出限为0.30 mg/kg，定量限为1.0 mg/kg。萃取条件为乙腈为萃取溶剂，体积比1∶1，超声提取10 min。该方法的加标回收率为82.5%～90.6%，RSD为2.9%～3.7%，所建立的方法具有可靠的准确度和精密度，能准确快速有效地检测运动型饮料中GABA的含量，可为运动型饮料中γ-氨基丁酸的分析和监控提供技术支持。