吴桂君，陈晓倩，刘永衡

（1.银川能源学院 生物工程系，宁夏 永宁 750105；2.广西中医药大学 研究生院，广西 南宁 530001；3.宁夏工商职业技术学院 化工工程系，宁夏 银川 750000）

赤霞珠（Cabernet Sauvignon）、蛇龙珠（Cabernet Gernischt）和品丽珠（Cabernet Franc）属于Carbernet系列品种，被称为“三珠”，以其独特的酒质成为世界著名酿酒品种[1-3]。蛇龙珠属于欧亚类群，原产法国，是我国目前栽培面积最大的酿酒红葡萄品种。我国的葡萄种植多集中于新疆、山东、宁夏、河北、辽宁、山西、吉林和河南等地。特别近十年葡萄栽培面积和产量一直呈上升趋势。我国葡萄年产量约200万t，栽培面积据世界第六位，产量据世界第五位，中国葡萄在世界已占有一席之地[4-6]。随着葡萄酒产业在我国快速的发展，葡萄酒酿制过程中产生了大量的葡萄皮渣，其中主要是葡萄皮、葡萄籽和果梗等。目前这些皮渣主要被用作饲料、肥料，其综合利用率较低，造成很大的浪费[7]。

果醋是一种营养丰富、风味优良的酸味调味品，它兼有水果和食醋的营养保健功能，最重要的是它可以以果渣为主要原料进行酿制，目前全国各地醋吧的兴起，特别是在我国南方大中城市，食用果醋已成为一种时尚，在饮料中大有后来居上之势[8]。科学研究发现，果醋具有多种功能，果醋能促进新陈代谢，调节酸碱平衡，消除疲劳，果醋中含有10种以上的有机酸和人体所需的多种氨基酸[9]。目前关于葡萄皮渣综合利用的相关研究很多，如牛蕾等[10]对葡萄皮渣中的组成成分的研究，王占勇等[11]还研究了从葡萄皮中提取果胶等。本试验以葡萄皮渣酿制的原酒为基础，添加恶臭醋酸杆菌（A cetobactor rancens）浑浊变种AS1.41进行醋酸发酵试验，探讨接种量、发酵温度、摇床转速、初始酒精含量对醋酸转化率的影响，并设计了4因素4水平正交试验，确定出最佳发酵条件和试验方案，为后续新产品开发和品质分析提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

蛇龙珠葡萄皮渣原酒：由蛇龙珠葡萄皮渣酒精发酵所得，酒精度7.6%vol。

恶臭醋酸杆菌（Acetobactor rancens）混浊变种AS1.41：上海北诺生物科技有限公司。

醋酸菌斜面培养基：葡萄糖1g，酵母膏1g，CaCO31.5g，体积分数为95%乙醇2mL（灭菌后加入），琼脂2g，水100mL。

醋酸菌液体培养基：葡萄糖1g，酵母膏1g，CaCO31.5g，体积分数为95%乙醇2 mL（灭菌后加入），水100 mL[12]。

1.1.2 试剂

葡萄糖（分析纯）、NaOH（分析纯）、CaCO3（分析纯）、酚酞（指示剂）、酒石酸（分析纯）、酵母膏（生化试剂）、琼脂（生化试剂）、无水乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

pH320酸度计：上海雷磁电化学分析仪器公司；FUS-XL型10L发酵罐：上海国强生化装备有限公司；DA-130N手持式数字酒精计：日本KEM生产；DHP-500W型电热恒温培养箱、YXQ-LS-75S11型立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HCQ-QX全温振荡器：常州华冠仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 指标测定方法

酒精度的测定：蒸馏法和手持式数字酒精计[13]；总酸度的测定：酸碱中和滴定法[14]。

1.3.2 醋酸菌活化培养工艺

醋酸菌一级培养：在无菌状态下，将选用的醋酸菌接入10 mL试管，30℃培养72 h为一代菌种。醋酸菌二级培养：在无菌状态下，用无菌生理盐水将生长良好的二代种子接入装有发酵培养基的三角瓶中，500 mL三角瓶中装液50 mL，接种量10%，在30℃、150 r/min振荡培养72 h。瓶内有菌膜产生，培养基变浑浊，达到醋酸菌旺盛繁殖期即可。镜检后要求无杂菌。

1.3.3 醋酸发酵工艺流程

1.3.4 操作要点

（1）葡萄皮渣原酒：将5 kg葡萄皮渣放入发酵罐（20 L）中，添加蒸馏水不超过总容量的70%，将糖度调整为18%，灭菌（93～95℃，30 s）后接入0.6%的酵母菌，26～28℃酒精发酵6 d，酒精度为7.6%vol。

（2）醋酸发酵：将过滤后的原酒采用无水乙醇或蒸馏水调整至适合的酒精度，接入活化培养后的醋酸菌进行醋酸发酵，以醋酸含量不再升高为终点。

（3）澄清杀菌：取上清液以0.45μm聚醚砜滤膜精滤；杀菌温度60～70℃，时间10 min[15-16]。

1.3.5 醋酸转化率的计算方法

式中：0.8为20℃时乙醇的密度，g/cm3；1.304为理论上醋酸与乙醇的质量比。

1.3.6 醋酸发酵工艺单因素试验

将葡萄皮渣发酵酿制的葡萄酒采用无水乙醇或蒸馏水调整适宜的酒精度进行醋酸发酵。试验采用液态振荡发酵，发酵时间为10 d。分别以发酵温度（26℃、28℃、30℃、32 ℃、36 ℃），初始酒精度（6%vol、7%vol、8%vol、9%vol、10%vol），醋酸菌接种量（6%、8%、10%、12%、14%）及摇床转速（100 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min）4个因素为考察对象，醋酸转化率为指标，研究各因素对醋酸发酵的影响。

1.3.7 醋酸发酵条件优化正交试验

试验方案采用4因素4水平正交试验设计，在单因素醋酸发酵试验基础上，选取接种量、发酵温度、摇床转速、初始酒精含量4个主要因素，以醋酸转化率作为评价指标，利用DPS7.05软件确定最优发酵工艺参数，同时得出最优试验组合，采用最小显著差数法进行显著性分析，筛选出醋酸发酵工艺最优组合，因素与水平编码见表1。

表1 醋酸发酵工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for acetic acid fermentation conditions optimization

2 结果与分析

2.1 不同发酵条件对葡萄皮渣醋酸发酵的影响

2.1.1 不同温度对醋酸发酵的影响

取200 mL酒精含量10%vol的果酒装入500 mL三角瓶中，纱布封口后灭菌（93～95℃、30 s），然后接入活化后的醋酸菌种10%，放置在26℃、28℃、30℃、32℃、36℃全温摇床中发酵培养，转速180 r/min，10 d内每天测定一次酸度和酒精度，计算出醋酸转化率，最终确定在醋酸发酵过程中合适的发酵温度。其结果如图1所示。

图1 温度对醋酸发酵的影响Fig.1 Effect of temperature on acetic acid fermentation

由图1可知，在26～36℃发酵温度范围内，随着温度上升，醋酸菌生长代谢较旺盛，醋酸转化率稳步提升。温度在26℃时，虽然转化率始终在提高，但是相对其他温度时曲线偏低，当温度在36℃时反而抑制了醋酸菌的活力，醋酸转化率较低。因此，选取温度28℃、30℃、32℃、34℃四个水平进行醋酸发酵正交试验。

2.1.2 不同接种量对醋酸发酵的影响

取200 mL酒精含量10%vol的果酒装入500 mL三角瓶中，纱布封口后灭菌（93～95℃、30 s），然后分别以接种量6%、8%、10%、12%、14%接入活化后的醋酸菌种。30℃条件下全温摇床中发酵培养，转速180 r/min，10 d内每天测定一次酸度和酒精度，计算出醋酸转化率，最终确定在醋酸发酵过程中合适的接种量，其结果如图2所示。

图2 接种量对醋酸发酵的影响Fig.2 Effect of inoculum on acetic acid fermentation

由图2可知，接种量的多少对于醋酸发酵影响不大，只是接种量较大时在发酵初期，发酵速度较快，接种量较小时发酵速度较慢，转化率也相应低一些，但是随着发酵时间的延长，各接种量醋酸转化率差距明显变小，接种量在12%时醋酸转化率最高。因此，选取接种量6%、8%、10%、12%四个水平进行醋酸发酵正交试验。

2.1.3 不同初始酒精含量对醋酸发酵的影响

取200 mL果酒装入500 mL三角瓶中，纱布封口后灭菌（93～95℃，30 s），然后分别接入活化后的醋酸菌种10%，调整初始酒精含量为6%vol、7%vol、8%vol、9%vol、10%vol。30℃条件下全温摇床中发酵培养，转速180 r/min，10 d内每天测定一次酸度和酒精度，计算出醋酸转化率，最终确定在醋酸发酵过程中合适的初始酒精含量，其结果如图3所示。

初始酒精度越低，对醋酸菌抑制越小，在发酵初始阶段，产酸较快。由图3可知，当酒精度在9%vol和10%vol时，过高的酒精度抑制了醋酸菌的生长，醋酸转化率在第5天以后增长幅度明显变小，酒精度在6%vol～8%vol时，转化率相对较高，由图3可知初始酒精度7%vol发酵10天达到最大转化率，但是从整个曲线图的变化趋势上观察，酒精度在8%vol的时候，第5天以前转化率提高速度较快，之后稳定增长，第10天左右有所降低，这是由于发生过氧化作用，醋酸转化率开始下降。因此，初始酒精度选取6%vol、7%vol、8%vol、9%vol四个水平进行醋酸发酵正交试验。

图3 初始酒精含量对醋酸发酵的影响Fig.3 Effects of initial alcohol content on acetic acid fermentation

2.1.4 不同摇床转速对醋酸发酵的影响

取200 mL酒精含量10%vol的果酒装入500 mL三角瓶中，纱布封口后灭菌（93～95℃、30 s），然后分别接入活化后的醋酸菌种10%，30℃条件下全温摇床中发酵培养，分别选取100 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min五个转速进行醋酸发酵，10 d内每天测定一次酸度和酒精度，计算出醋酸转化率，最终确定在醋酸发酵过程中合适的摇床转速，其结果如图4所示。

图4 摇床转速对醋酸发酵的影响Fig.4 Effect of rotating speed on acetic acid fermentation

醋酸菌发酵属于好氧发酵，在氧化乙醇产生醋酸过程中需提高通氧量。由图4可知，在较低的转速100 r/min时，通氧量较低，发酵后期醋酸转化率一直不高，当摇床转速为200 r/min时，初期发酵旺盛，这是由于通氧量过高，醋酸菌大量生长繁殖，生长因子消耗过大，同时转速过高加快了乙醇的挥发，所以在发酵后期曲线出现了下降的拐点，醋酸转化率反而降低。因此，摇床转速选取140 r/min、150r/min、160 r/min、170 r/min四个水平进行醋酸发酵正交试验。

2.2 葡萄皮渣醋酸发酵条件的优化

在单因素试验基础上，选取温度、初始酒精含量、接种量和摇床转速为评价因素，醋酸转化率为评价指标进行正交试验设计，具体试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 醋酸发酵条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for acetic acid fermentation conditions optimization

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

从表2、表3可知，醋酸发酵的4个因素中，初始酒精含量是最主要影响因素，其次是发酵温度，最后是摇床转速和接种量。显著性检验表明，发酵温度、初始酒精含量、接种量、摇床转速对醋酸转化率的影响均为极显著水平（P＜0.01），最优的组合是A2B2C2D4，即温度为30℃，初始酒精含量7%vol，醋酸菌接种量8%，摇床转速170 r/min，在此条件下测得醋酸转化率为92.26%。

2.3 讨论

目前我国关于葡萄皮渣果醋报道很少，相关研究还处于起步阶段，对于下一步果醋酿造还需要解决以下问题：葡萄皮渣酿造过程中醋酸菌选育优化对产品品质有至关重要的作用，也是果醋产品品质产生差距的原因之一，但是由于时间和条件的限制未对菌种进行选育，今后可以采用物理诱变、化学诱变、原生质体融合等手段对此进行研究。同时本研究只针对宁夏本地酿酒葡萄品种皮渣酿制果醋做出了研究，并未涉及到区外其他地区葡萄品种的发酵研究，也未涉及到鲜食葡萄皮渣的发酵研究，故在今后的实践过程中，将在本研究的基础上，展开更加深入的探索。

3 结论

醋酸发酵阶段初始酒精量、醋酸菌接种量、发酵温度、摇床转速都对醋酸转化率有重要影响，其中通过单因素试验确定了最适宜的工艺控制参数范围，又通过4因素4水平正交试验确定了最佳试验组合方案，即：温度30℃，初始酒精含量7%vol，醋酸菌接种量8%，摇床转速170 r/min，此条件下醋酸转化率为92.26%，其主要影响因素为初始酒精含量和发酵温度。