许超群，李 啸，*，程 奔，黄 聪，张小龙，叶 晗

（1.三峡大学 生物与制药学院，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

酵母自溶（yeast autolysis）是指酵母细胞在特定条件下，经蛋白酶、核酸酶、脂类酶等内源酶（系）将自身内容物降解并释放的过程。友好条件下的酵母自溶是安全、稳定和高效获得优质酵母溶出物（俗称酵母抽提物）的方式。

目前，国内外对酵母“自溶”的研究主要集中在添加非极性有机溶剂、酸碱和无机盐等[1-4]，通过改变细胞膜通透性加速其胞内物质浸出。此类研究成果被广泛应用于酵母抽提物工业化生产[5-8]，一方面有微生物污染的风险，另一方面，引入的高浓度离子会对亚健康人群造成较大危害[9]。据报道，通过高压均质[10]和脉冲电场作用[11]破坏酵母细胞壁和细胞膜结构，加速酵母胞内物质溶出，虽然没有外物污染风险，但大量细胞碎片难于高效分离，此类研究成果较难产业化。酵母抽提物现已作为第三代天然调味料应用于食品工业，对其品质提出了“绿色无公害”的要求[12]。经统计，国际和国内市场酵母抽提物的总需求量分别为26万t和6万t左右，且生产原料基本以面包酵母为主。但由于面包酵母内源性自溶酶（系）较为复杂，对其作用机制认知不够，未能充分发挥内源酶（系）作用，导致自溶收率难以提高[13]，细胞内残留物质多。有研究报道，添加外源酶（如木瓜蛋白酶，β-葡聚糖酶和溶菌酶）可以显著增加酵母细胞中大分子营养物质的生物降解，加速自溶，并获得理想的实验结果。酵母抽提物实现安全清洁制造的关键就是自溶及酶解，故对面包酵母进行酶联辅助自溶工艺的研究具有非常重要的现实意义。

本研究主要考察了添加甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、β-葡聚糖酶对面包酵母（Saccharomycescerevisiae）FX-2辅助自溶过程的影响，应用正交试验设计确定各酶的最佳助溶条件，并进一步比较验证单酶、双酶和多酶联用的助溶能力，获得条件较为友好的面包酵母酶法辅助自溶工艺，为酵母抽提物的绿色高效开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

面包酵母（Saccharomycescerevisiae）FX-2（CCTCCNo：M2016418）、甘露聚糖酶（有效范围50～55℃、pH4.5～6.0，5万 U/g）、β-葡聚糖酶（有效范围50～55 ℃、pH 5.0～6.5，5万U/g）：安琪酵母股份有限公司；木瓜蛋白酶（有效范围50～60 ℃、pH5.0～7.0，10万 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；蜗牛酶（有效范围30～40℃、pH5.8～7.2，对酵母细胞壁的溶解活性：每1μg的酶2 h内30℃水浴中可有效降解1.28×106个酵母）：上海鼓臣生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-S4型数字恒温水浴锅：金坛市城西春兰实验仪器厂；TDL-60B型飞鸽牌系列离心机：上海安亭科学仪器厂制造；AL204-IC型电子天平、FE20型pH计：瑞士METTLER TOLEDO公司；MA45型水分快速测定仪：黑龙江龙泽科技发展有限公司；XSP-2C型光学显微镜：上海长方光学仪器有限公司；KDN-103F型凯氏自动定氮仪：上海纤检仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 面包酵母FX-2酶法助溶单一对照试验

配制干物质含量为13%的酵母乳，测定其pH，分别添加甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、β-葡聚糖酶、蜗牛酶，在各酶的有效作用范围内于恒温水浴锅中进行面包酵母酶法助溶处理，每2 h取样一次，测定自溶酵母乳离心上清液干物质含量及细胞死亡率。

1.3.2 分析检测

细胞死亡率测定：取稀释一定浓度的自溶酵母乳0.1mL，滴加次甲基蓝染液0.9 mL，染色10 min，用血球计数板计数，无色（A）为活菌，蓝色（B）为死菌，计算细胞死亡率，其计算公式如下：

自溶酵母乳离心上清液干物质含量测定：取15 mL酵母乳，于5 000 r/min离心10 min，称取5.1～6.9 g上清液，于水分快速测定仪上测定水分含量，从而计算干物质含量。酵母细胞壁葡聚糖和甘露聚糖含量测定采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[14]，总氮和氨基酸态氮含量测定分别采用微量凯氏定氮法和甲醛滴定法[15]。

1.3.3 面包酵母FX-2辅助自溶条件确定单因素试验

13%酵母乳于不同条件下进行酶法助溶处理12 h，以细胞死亡率及离心上清液干物质含量为评价指标，分别考察酶添加量、pH、温度对各酶（甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶）辅助酵母自溶过程的影响。

1.3.4 正交试验

根据单因素试验结果，选取酶添加量、pH、温度3个对面包酵母辅助自溶过程影响较大的因素，以细胞死亡率为评价指标，选用L9（33）正交试验设计，优化各酶辅助酵母自溶的条件，试验因素与水平见表1。

表1 酶辅助自溶条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzyme assisted-autolysis conditions optimization

1.3.5 单酶、双酶和多酶联用助溶能力比较

在正交试验结果基础上，以细胞死亡率和离心上清液干物质含量为评价指标，同时检测细胞壁氨基酸态氮、总氮、葡聚糖和甘露聚糖等成分的含量，比较并验证单酶、双酶和三酶联用的助溶能力。其中双酶和多酶联用助溶过程中，加酶顺序按酵母细胞壁由外到内的组分相对应的水解酶种类进行，加酶时间间隔为30 min，具体方案见表2。

表2 助溶能力验证实验方案设计Table 2 Validation experiments design for assisted-autolysis ability

2 结果与分析

2.1 面包酵母FX-2酶法助溶单一对照试验结果

不同酶在各自有效作用条件下[甘露聚糖酶（52.5℃、pH 6.0）、木瓜蛋白酶（52.5℃、pH6.0）、β-葡聚糖酶（52.5℃、pH6.0）和蜗牛酶（37℃、pH6.0）]，辅助酵母自溶的效果，结果见图1。

图1 不同酶对面包酵母FX-2辅助自溶效果的影响Fig.1 Effect of different enzymes on the assisted-autolysis performance of baker's yeast FX-2

由图1可知，甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、β-葡聚糖酶在面包酵母辅助自溶过程中均有明显的作用效果，其中木瓜蛋白酶效果最为显著（图1B），与空白组相比，加酶组酵母乳离心上清液干物质含量较高，且细胞死亡速率明显加快。甘露聚糖酶（图1A）和β-葡聚糖酶（图1C）分别在6 h和10 h左右开始加速酵母自溶，体现在加酶组细胞死亡率和离心上清液干物质含量的提高，其中β-葡聚糖酶发挥作用的时间相比较晚，可能是由于前期酵母细胞壁完整，β-葡聚糖酶较难作用于细胞壁葡聚糖内层造成的。相反，蜗牛酶作用效果较小（图1D），在连续自溶24 h的过程中，与空白组相比，加酶组细胞死亡率和离心上清液干物质含量均无明显提升，这可能是由于酵母细胞在蜗牛酶的作用环境中（37℃），温度压力小，仍具有较高活性，加之酵母特有的坚固细胞壁结构，使其在友好温度下具有较强的应激抗性。结合上述实验结果分析，可知酵母辅助自溶过程不仅受外加酶种类的影响，还在很大程度上受温度的影响。基于此，选择效果较为明显的甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶做进一步研究。

2.2 面包酵母FX-2辅助自溶条件确定单因素试验结果

2.2.1 甘露聚糖酶助溶单因素试验结果

在甘露聚糖酶的有效作用条件（即pH5.5，温度52.5℃）下，研究了酶添加量对酵母辅助自溶效果的影响见图2A，由图2A可知，酶添加量为0.6‰时，细胞死亡率相对较高，效果较好；在酶添加量为0.6‰，温度52.5℃的条件下，研究了pH对助溶效果的影响见图2B，由图2B可知，pH5.5时，细胞死亡率及酵母乳离心上清液干物质含量均较高，表明该pH条件更有利甘露聚糖酶辅助酵母自溶，而pH较低时（＜5.0），助溶效果差，这可能是由于甘露聚糖酶的活性受到了部分抑制；在酶添加量为0.6‰，pH5.5的条件下，研究了温度助溶效果的影响见图2C，由图2C可知，随温度的上升，助溶程度不断提高，这可能是由于温度越高，酵母细胞所受的环境压力也越大，其自身压力应激反应会激活胞内相关自溶酶（系），加速细胞瓦解[1]。而当温度＞55.0℃时，助溶程度放缓，这可能是由于温度较高，抑制了酶的活性，导致细胞壁甘露聚糖层的水解过程受到影响，因此选择55.0℃为最适温度。

图2 不同因素对甘露聚糖酶辅助面包酵母自溶效果的影响Fig.2 Effects of different factors on the mannase assisted-autolysis performance of baker's yeast

2.2.2 木瓜蛋白酶助溶单因素试验结果

在木瓜蛋白酶有效作用范围内，选择pH5.5，温度52.5℃为初始条件，考察了酶添加量对酵母酶法助溶效果的影响见图3A，由图3A可知，在酶添加量为0.4‰时，细胞死亡率达到最大值，酶添加量＞0.4‰时，离心液干物质含量虽有较小幅度提升但变化不大且较为稳定，因此选择0.4‰为最适酶添加量；在酶添加量为0.4‰，温度52.5℃的条件下，不同pH值对助溶效果的影响见图3B，由图3B可知，pH5.5时，细胞死亡率及离心上清液干物质含量同时达到最高水平，表明该pH条件更有利木瓜蛋白酶的辅助酵母自溶过程，而pH值较低或较高时，助溶效果较差；在最适酶添加量0.4‰、最适pH5.5的条件下，研究了温度对酵母助溶过程的影响见图3C，从图3C可知，随温度的升高，酵母助溶程度也不断提高，当温度达到55.0℃时，酵母细胞基本全部死亡（细胞死亡率＞95%），进一步说明酵母细胞响应高温压力会加速自身降解，随着温度的进一步升高，自溶酵母乳离心上清液干物质含量仍不断提高，这是由于酵母死亡后，较高的温度会加速细胞瓦解，如破坏细胞壁结构，造成壁孔，加速胞内物质逸出[11]，但高温剧烈条件，会影响酵母内源自溶酶（系）的作用，抑制部分木瓜蛋白酶的水解活性，并且加大能耗，因此选择最适温度为55.0℃。

图3 不同因素对木瓜蛋白酶辅助面包酵母自溶效果的影响Fig.3 Effects of different factors on the papain assisted-autolysis performance of baker's yeast

2.2.3 β-葡聚糖酶助溶单因素试验结果

在β-葡聚糖酶的有效作用范围内，选择pH5.5，温度52.5℃为初始条件，考察了酶添加量对酵母助溶效果的影响见图4A，由图4A可知，酶添加量为0.2‰时，细胞死亡率和离心液干物质含量均相对较高，助溶效果较好；在酶添加量为0.2‰，温度52.5℃的条件下，不同pH值对助溶效果的影响见图4B，由图4B可知，当pH＞6.0时，助溶程度明显较低，说明该pH条件不利酵母自身内源水解酶（系）及外源β-葡聚糖酶发挥作用，考虑到自然酵母乳一般呈偏酸性（pH＜6.0），选择pH 5.5为最适条件；在酶添加量0.2‰，pH 5.5的条件下，研究了温度对酵母助溶过程的影响见图4C，由图4C可知，随温度的上升，自溶酵母乳离心上清液干物质含量不断提高，但细胞死亡率在温度＞52.5℃时呈现出下降趋势，在57.5℃时又出现回升，这充分说明较高的温度（＞52.5℃）会影响β-葡聚糖酶的活性，减缓酵母细胞壁水解过程，降低细胞死亡率，而当温度过高时（＞57.5℃），酵母细胞难以耐受环境条件，加速自身瓦解，释放胞内物质。综合考虑，选择52.5℃为最适温度。

图4 不同因素对β-葡聚糖酶辅助面包酵母自溶效果的影响Fig.4 Effects of different factors on theβ-glucanase assisted-autolysis performance of baker's yeast

2.3 正交试验结果

根据单因素试验结果，以细胞死亡率为评价指标，分别按照表1、表2和表3的设计进行了甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶辅助酵母自溶条件的进一步优化，正交试验结果与分析如表3～表5所示。

由表3可知，甘露聚糖酶助溶条件对面包酵母死亡率（酶法辅助自溶效率）的影响顺序为C（温度）＞B（pH）＞A（酶添加量），细胞死亡率最高的条件组合是A2B3C2，即酶添加量0.6‰，pH 6.0，温度55.0℃。在此最佳条件下助溶12 h，细胞死亡率为98.26%，同时酵母乳离心上清液干物质含量达5.47%。由表4可知，木瓜蛋白酶助溶条件对细胞死亡率的影响顺序为C（温度）＞B（pH）＞A（酶添加量），细胞死亡率最高的条件组合是A3B2C3，即酶添加量0.6‰，pH 5.5，温度57.5℃。在此最佳条件下4进行验证试验，细胞死亡率为100%，同时酵母乳离心上清液干物质含量达9.21%。由表5可知，β-葡聚糖酶助溶条件对细胞死亡率的影响顺序为C（温度）＞A（酶添加量）＞B（pH），细胞死亡率最高的条件组合是A2B3C3，即β-葡聚糖酶添加量0.2‰，pH 6.0，温度55.0℃。在此最佳条件下，进行验证试验，细胞死亡率为97.92%，同时酵母乳离心上清液干物质含量达5.18%。结果表明，木瓜蛋白助溶效果最好，其次是甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶。

表3 甘露聚糖酶辅助自溶条件优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for mannanase assisted-autolysis conditions optimization

表4 木瓜蛋白酶辅助自溶条件优化正交试验结果与分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for papain assisted-autolysis conditions optimization

表5 β-葡聚糖酶辅助自溶条件优化正交试验结果与分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for β-glucanase assisted-autolysis conditions optimization

2.4 单酶、双酶和多酶联用助溶能力比较验证实验结果

基于正交试验的优化结果，按照表4设计实验，助溶10h（单酶助溶12 h，各方案下酵母细胞死亡率分别为98.26%，100%和97.92%，即接近全部死亡或全部死亡。基于多酶联用优于单酶作用效果，可以缩短助溶时间，选择10 h为评判终点，进一步优化助溶工艺），测定细胞死亡率及酵母乳离心干物质含量，比较不同单酶及复合酶对酵母助溶过程的作用效果，结果见图5。

图5 各方案辅助自溶效果比较Fig.5 Comparison of assisted-autolysis performance of different scheme

由图5可知，在单酶作用方案中，木瓜蛋白酶（c）的作用效果最好，其次是甘露聚糖酶（a）和β-葡聚糖酶（b），这与正交试验的结果基本相符。从细胞死亡率和酵母乳离心上清液干物质含量的高低水平来看，双酶（d、e、f）和多酶联用（g）方案的助溶效果均优于单酶方案。在双酶方案中，木瓜蛋白酶＋β-葡聚糖酶（e）效果最好，其次是甘露聚糖酶＋木瓜蛋白酶（f）和甘露聚糖酶＋β-葡聚糖酶（d）。甘露聚糖酶＋木瓜蛋白酶＋β-葡聚糖酶的三酶联用方案（g）助溶效果基本与e方案相当，表现在两方案的细胞死亡率均达到100%，其中e方案的离心液干物质含量稍高于g方案。因此，选择双酶组合e为最优方案，即13%酵母乳调pH至5.5，添加0.6‰木瓜蛋白酶，于57.5℃助溶30 min后，调节温度为55 ℃、pH为 6.0、添加0.2‰β-葡聚糖酶，助溶至10 h。该条件下，细胞死亡率及酵母乳离心上清液干物质含量分别达100%和9.40%。

为验证优化方案的可靠性，收集各助溶方案下的酵母细胞壁检测相关指标，结果见图6和表6。

图6 面包酵母辅助自溶细胞壁检测数据Fig.6 The cell wall detection data of baker's yeast after assisted-autolysis

表6 面包酵母辅助自溶细胞壁各组分含量变化Table 6 Content changes of cell wall components in baker's yeast assisted-autolysis%

由图6和表8可知，方案e条件下，酵母细胞壁总氮、葡聚糖及甘露聚糖含量均较低，表明该方案下，细胞壁水解相对充分，其水解度高达54.41%，酵母自溶率理想；而氨氮含量为1.45%，相对较高，进一步说明酵母细胞壁蛋白质层水解严重，酵母溶解程度提高，这与图5中结果相符，验证了方案e的可靠性。

3 结论

本项目主要研究了外源酶添加对面包酵母（Saccharomycescerevisiae）FX-2辅助自溶过程的影响。通过单因素试验和正交试验确定不同外源酶辅助酵母自溶效率最高的条件，效果最好的为木瓜蛋白酶：酶添加量为0.6‰，pH 5.5，助溶温度57.5℃。该条件下，助溶12 h，细胞死亡率达100%，同时酵母乳离心上清液干物质含量也高达9.21%。在此基础上，进一步研究了单酶、双酶和多酶联用的助溶能力，获得条件友好的面包酵母酶法助溶工艺：13%酵母乳调pH至5.5，添加0.6‰木瓜蛋白酶，于57.5℃条件下助溶30min后，调节温度为55℃、pH为6.0、添加0.2‰β-葡聚糖酶，助溶至10 h。该工艺下，细胞死亡率及离心上清液干物质含量分别为100%和9.40%，同时细胞壁水解程度高达54.41%，进一步优化了面包酵母酶法助溶过程，缩短助溶时间。

本研究开发的面包酵母FX-2酶法助溶工艺，操作简单，条件温和，助溶效率高，对酵母自溶工艺的优化及高品质酵母抽提物的生产具有一定的指导意义，且应用前景良好。