吴 宏，代文婷，连喜军，郭安民，吴洪斌

（1.新疆农垦科学院 农产品加工研究所，新疆 石河子 832000；2.新疆农垦科学院 农产品加工重点实验室，新疆 石河子 832000；3.天津商业大学 天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）

红曲霉菌（Monascus）属于真菌界，子囊菌门，子囊菌纲，散囊菌目，红曲科，由法国科学家Van Tieghem于1884年分类并命名[1]。中国红曲发酵始于唐朝，主要用于腐乳、民间医药、食品着色剂、发酵剂和红米酒[2]。红曲色素是红曲霉代谢过程中产生的系列聚酮类化合物，是微生物发酵法工业化生产的天然色素，广泛应用于食品、医药及化妆品领域[3-5]。红曲色素的传统生产方式为固态发酵，其生产率低，耗粮多，而液体发酵具有生产周期短、工艺简便、安全性高的特性[6]。目前，优化红曲菌发酵培养基质及条件是提高红曲色素生产水平和降低桔霉素含量的有效途径之一[7]。桔霉素是红曲霉代谢产生的一种真菌毒素，具有显著的肾毒性、肝毒性、致癌、致畸性及免疫毒性[8-12]。自法国科学家Blanc1995年首次在红曲中发现强毒性桔霉素后，国内外针对红曲产品的安全性提出了制约条件。日本规定红曲色素中桔霉素限制标准为0.2 mg/kg[13]。美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）规定红曲色素中含有的桔霉素安全性合格后才能作为食品添加剂使用。欧洲规定了只允许不含桔霉素的产品进口和销售[14-15]。

该研究在前期新疆及其他地区腐乳中分离纯化得到的10株红曲菌的基础上，经过18种液体培养基发酵，分析其次级代谢产物——红色素和桔霉素，筛选出产红色素能力强、低产或不产桔霉素的菌株。通过探索不同地区红曲霉的红色素产量以及产桔霉素的特性，以期为红曲霉在食品工业中更好地发挥作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 主要材料

10株红曲霉菌为本实验室前期从不同地区腐乳中分离纯化得到[16]，其中红曲霉菌“连天津”为实验室现有红曲霉；ZBX新疆：分离自新疆大块红腐乳；BCQ吉林：分离自吉林朱老六红腐乳；BCQ广东：分离自广东广利达南乳红腐乳；ZBX天津：分离自天津利民红腐乳；BCQ（D）：分离自北京老才臣大块红腐乳；ZBX（8）：分离自北京老才臣玫瑰腐乳；ZBX（D）：分离自北京王致和大块红腐乳；9（M）：分离自北京王致和玫瑰腐乳；9（H）：分离自北京王致和红辣腐乳。

1.1.2 主要试剂

大豆分离蛋白（食品级）：谷神生物科技集团有限公司；碱性蛋白酶（2×106U/g，食品级）：天津滨海诺奥科技发展有限公司；红曲红素标准品（纯度≥99.0%）：上海洽姆仪器科技有限公司；蛋白胨、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DZKW-S-4电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；YX-18LM手提式压力蒸汽灭菌器高压锅：江阴滨江医疗设备有限公司；L535-1低速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SW-CJ-1F单人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；HNY-111C恒温培养振荡器：天津市欧诺仪器仪表有限公司；TU-1901分光光度计：北京谱析责任有限公司；LCQ-Advantage液质（liquid chromatographymass spectrometr，LC-MS）联用仪：美国Thermo-Finnigan公司。

1.3 方法

分别用麦芽糖、葡萄糖和蔗糖为碳源，并分别以蛋白胨、大豆分离蛋白、大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解液、面筋碱性蛋白酶水解液、碱溶蛋白碱性蛋白酶水解液和醇溶蛋白碱性蛋白酶水解液做氮源，制成18种发酵培养基，将新疆和其他地区分离得到的10株红曲霉菌株分别于18种液体培养基中发酵培养，然后进行发酵代谢产物红曲色素和桔霉素的吸光度值测定和质谱分析，最终确定适合的红曲霉液体培养基和高产红曲色素低产桔霉素的红曲霉菌株。

1.3.1 红曲霉液体培养基的制备

（1）制备大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解液：将7%的大豆分离蛋白水溶液煮开放凉，用NaOH调节pH=8.0，加入0.1%的碱性蛋白酶，于55℃恒温条件下酶解5 h；

（2）制备面筋碱性蛋白酶水解液：将7%的面筋水溶液煮开放凉，用NaOH调节pH=8.0，加入0.1%的碱性蛋白酶，于55℃恒温条件下酶解5 h；

（3）制备碱溶蛋白碱性蛋白酶水解液：将7%的碱溶蛋白水溶液煮开放凉，用NaOH调节pH=8.0，加入0.1%的碱性蛋白酶，于55℃恒温条件下酶解5 h；

（4）制备醇溶蛋白碱性蛋白酶水解液：将7%的醇溶蛋白水溶液煮开放凉，用NaOH调节pH=8.0，加入0.1%的碱性蛋白酶，于55℃恒温条件下酶解5 h；

（5）分别用麦芽糖、葡萄糖和蔗糖为碳源，以蛋白胨、大豆分离蛋白、大豆分离蛋白碱性蛋白酶水酶解液、面筋碱性蛋白酶水解液、碱溶蛋白碱性蛋白酶水解液和醇溶蛋白碱性蛋白酶水解液作氮源，制作18种发酵培养基，通过后续发酵确定最适培养基组成。培养基设计：100 mL发酵液：添加3%碳源+1%氮源，①代表蛋白胨，②代表大豆分离蛋白，③代表大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解液，④代表面筋碱性蛋白酶水解液，⑤代表碱溶蛋白碱性蛋白酶水解液，⑥代表醇溶蛋白碱性蛋白酶水解液。麦芽糖以M表示，葡萄糖以P表示，蔗糖以Z表示。18种发酵培养基设计如下：①+M、①+P、①+Z、②+M、②+P、②+Z、③+M、③+P、③+Z、④+M、④+P、④+Z、⑤+M、⑤+P、⑤+Z、⑥+M、⑥+P、⑥+Z。

1.3.2 液体培养基的灭菌与接种培养

将3%碳源、1%氮源、100 mL水加入三角瓶中，用纱布、牛皮纸封口，放入蒸汽高压灭菌锅，121℃灭菌20min，灭菌后冷却至室温。将分离纯化后的不同红曲霉菌株接种到液体培养基中，置于摇床中，32℃、180r/min条件下培养48h。

1.3.3 吸光度测定与含量计算

将经过48 h发酵后的红曲霉发酵液逐一进行离心，分别取上清液，用分光光度计在波长490nm处测定吸光度值，根据标准曲线计算其色素产量。

1.3.4 质谱条件

质谱条件：电喷雾离子源；扫描方式为负离子扫描；雾化气压力为80 kPa；毛细管电压3.5 kV，干燥气温度180℃，干燥气流速6.0 L/min。

2 结果与分析

2.1 10株红曲霉在18种培养基发酵液的红曲色素含量

图1为红曲色素标准曲线。发酵液中的红曲色素含量由红曲色素标准液曲线计算得出，结果见表1。

图1 红曲红的标准曲线Fig.1 Standard curve of Monascus red

表1 红曲霉菌种发酵产色素量Table 1 Production of Monascus pigments from Monascus strains fermentation mg/100 mL

从表1中10株红曲霉对应的各种培养基发酵液中红曲色素产量可看出，红曲霉ZBX（8）在各培养基的最高红曲色素产量值为7.27×10-2mg/mL，对应培养基为②大豆分离蛋白+M麦芽糖培养基，而另外9株红曲霉中除了连天津红曲霉外，其他8株菌红曲色素产量最高的均集中在①蛋白胨+P葡萄糖培养基，红曲色素产量最高为6.81×10-2mg/mL，故最佳培养基为蛋白胨＋葡萄糖培养基。相比较而言，ZBX新疆的红曲色素在各培养基的最低产量较其他菌株高，连天津的红曲色素产量较低，分离自北京腐乳中的菌株红曲色素产量并不相似，广东腐乳中分离出的菌株红曲色素产量较东北腐乳中分离的菌株红曲色素产量要高。各菌株具体的红曲色素产量范围见表2。

表2 红曲霉的色素产量范围Table 2 Yield range of Monascus pigments mg/100 mL

由表2可知，新疆红曲霉的红色素产量最高，其范围为2.04×10-2～6.81×10-2mg/mL，并且其红色素产量达到最大值6.81×10-2mg/100 mL时所对应的培养基有11种，比较而言，新疆红曲霉为产红曲色素的最佳菌种。连天津红曲色素产量最低，其浓度范围0.35×10-2～5.79×10-2mg/100 mL。

2.2 10株红曲霉所对应的培养基发酵液中桔霉素质谱图分析

若发酵液含有桔霉素，则质谱图中出现的质核心（m/z）为249或251。红曲霉ZBX新疆在④+P培养基中培养48 h的发酵液质谱图分析结果见图2（代表性质谱图），含有桔霉素的红曲霉及其对应的发酵液培养基如表3所示。

图2 红曲霉ZBX新疆在面筋碱性蛋白水解液和葡萄糖发酵液的质谱图Fig.2 Mass spectrogram of Monascus ZBX-Xinjiang at hydrolytic solution of gluten alkaline protease and glucose fermentation liquid

由表3可知，新疆地区红曲霉只有在培养基为④+P的发酵液中出现了桔霉素，约为0.7×104ng/mL，该地区红曲霉在其余的发酵液中均无桔霉素检出；对于实验所涉及的所有发酵液来说，培养基为①+Z、②+Z、④+Z、⑤+M、⑤+Z、⑥+M、⑥+Z这7种发酵液中均无桔霉素；而红曲霉ZBX天津的所有发酵液中均未检测出桔霉素。3结论

表3 产桔霉素的红曲霉及其对应的发酵液培养基Table 3 Monascus strains with citrinin production and their corresponding fermentation medium

通过以上实验分析得出，在研究的多地区10株红曲霉及其对应的18种液体培养液中，红曲霉产色素量与红曲霉菌种和液体培养基组成有重要关联。在10株红曲霉菌种中，红曲霉ZBX（8）仅在②大豆分离蛋白+M麦芽糖培养基中红曲色素产量最高，为7.27×10-2mg/mL，新疆地区红曲霉的红色素产量达到最大值6.81×10-2mg/100 mL时所对应的培养基有11种；除了连天津红曲霉和ZBX（8）红曲霉，其余8株红曲霉色素产量最高的一组均集中在①蛋白胨+P葡萄糖培养基，红曲色素产量为6.81×10-2mg/mL；通过质谱分析，新疆地区红曲霉在18种液体培养基中仅在④面筋碱性蛋白酶水解液+P葡萄糖的发酵液中产生桔霉素，其余培养液中均无桔霉素产生，红曲霉ZBX天津的所有发酵液中均未产生桔霉素。综上所述，红曲霉ZBX天津安全性最强，而新疆地区红曲霉比其他地区红曲霉菌种产色素能力强。