徐蓉,丰宇芳,陈正红2#苏州大学附属张家港医院病理科,江苏 张家港 25600

2江苏省中西医结合医院妇产科,南京2100280

微小RNA(micro RNA,miRNA)由一类长度约为22个核苷酸的非编码单链分子组成,其特点是转录后可以水平调控靶基因的表达[1],对细胞的生长、迁移及凋亡均有非常重要的意义[1-2].相关研究表明,miRNA参与体内多种肿瘤的发生、发展过程,并且可以广泛调控肿瘤基因的表达,因此推测miRNA可能发挥癌基因或抑癌基因的作用[3].结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是全球发病率极高的一种肿瘤,病死率极高[4-5].结肠癌多表现为多基因及表观遗传改变[5].大量研究表明,在结肠癌的发生过程中,某些特定的miRNA起着重要调控作用,因此这些特定的miRNA可以成为结肠癌诊断和生物治疗的新靶标[6-9].还有研究显示,miRNA-95这类微小RNA能够通过调节癌基因,从而对多种肿瘤的发生、发展起到一定的作用[8,10-11].还有部分相关类型研究报道显示,miRNA-95能够通过抑制SNX1的表达,促进结肠癌细胞的增殖[8].但是关于miRNA-95-3p能否通过对其他基因进行调控,从而对结肠癌产生一定影响的研究尚少,因此,本研究对miRNA-95-3p在结肠癌患者中的表达情况及其对结肠癌细胞SW620增殖、迁移能力的影响进行探讨,现报道如下.

1 材料与方法

1.1 病理组织收集

收集2017年1-10月苏州大学附属张家港医院采集并保存的结肠癌患者的结肠癌组织及癌旁正常肠黏膜组织.纳入标准:①病理组织保存完好、完整,可用于后期实验操作;②与组织相匹配的患者信息全面,具有明确的结肠癌诊断信息;③除肿瘤组织外,还有对应的癌旁正常肠黏膜组织.排除标准:①病理组织有反复冻融情况,保存缺失不完整、不完好;②组织对应的患者病历资料不完整,无明确诊断信息;③无对应的癌旁正常肠黏膜组织.根据纳入和排除标准,本研究共选取10例结肠癌患者的结肠癌组织和癌旁正常肠黏膜组织.

1.2 细胞株及质粒

结肠癌SW620细胞株购自博士德生物工程公司(武汉);双荧光素酶报告质粒系统(pmirGLO Vector)委托吉玛公司(中国上海)构建与合成,该质粒体系概述如下:首先进行p21的3'-UTR区域全基因片段合成,在片段区域两端设计酶切位点,插入荧光虫荧光素酶(firefly luciferase)3'-UTR的克隆位点;该质粒也包含海肾荧光素酶(renilla luciferase)基因.

1.3 主要试剂

胎牛血清及胰蛋白酶购自美国Hyclone公司,LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司,总RNA提取试剂、逆转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒均购自美国Roch公司,实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)特异性定量引物和内参U6均由广州市锐博生物科技有限公司合成.OMEM培养基购自美国Invitrogen公司.

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 将SW620细胞接种于含10%胎牛血清+1%双抗的完全培养基中,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养;SW620细胞复苏后,以(2～5)X105/ml密度种植于培养瓶内,12 h后观察细胞的生长状态,采用0.25%的胰蛋白酶消化、传代(约2天1次),取对数生长期的SW620细胞用于后续实验.

1.4.2 实时荧光定量PCR检测miRNA-95-3 p表达 按照总RNA提取试剂操作说明提取结肠癌患者结肠癌组织和癌旁正常肠黏膜组织中的总RNA,采用紫外分光光度计检测总RNA的纯度和浓度.以上述提取的总RNA中的mRNA作为模板,按照mRNA逆转录说明书将所提取的mRNA逆转录为cDNA,保存于-20℃备用.将逆转录得到的cDNA用实时荧光定量PCR引物制备稀释后采用实时荧光定量试剂盒于实时定量PCR仪上进行扩增,检测miRNA-95-3p的表达情况,每个样本设计3个平行孔,共进行3次重复实验.每次检测均以U6为内参照,通过荧光定量法2-△△Ct计算miRNA-95-3p的相对表达量.

1.4.3 细胞转染 取对数生长期的SW620细胞,对SW620细胞进行分组:过表达组,转染miRNA-95-3p mimics;对照组,不进行转染.调整两组细胞浓度为(1.0～1.5)X106/ml,接种于6孔板中,常规培养,待细胞汇合度达到60%～70%时进行转染.将完全培养基更换为不含胎牛血清和双抗的基础培养基,每孔培养基1 ml,随后用100 μl OMEM稀释miRNA-95-3p mimics及LipofectamineTM2000,依照说明书推荐比例混匀后静置20 min,然后将混合溶液逐滴加入对应孔并轻晃混匀;温箱放置6 h后换成完全培养基继续培养48 h,收集两组细胞进行下一步分析.

1.4.4 CCK-8法检测SW620细胞的增殖情况 取过表达组和对照组SW620细胞,采用0.25%胰蛋白酶消化上述2组细胞,调整细胞浓度为1X105/ml,接种于96孔培养板,每孔培养基200 μl,置于37℃,5%CO2培养箱中培养48 h后,每孔加入CCK-8试剂200 μl,再持续培养2 h.采用酶标仪检测各孔在450 nm处光密度值(optical density,OD),以对应的OD值表示细胞增殖能力.

1.4.5 划痕实验 取过表达组和对照组SW620细胞,采用0.25%胰蛋白酶消化上述2组细胞,调整细胞浓度为1X105/ml,接种于6孔板中,置于37℃,5%CO2的培养箱中孵育培养,待细胞增长至汇合度80%以上时,用10 μl微量移液头消毒后在6孔细胞板上垂直划痕,采用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤细胞3次,24 h后在倒置显微镜下观察细胞的迁移情况.

1.4.6 Western blot检测各组细胞 p21蛋白的表达 收集培养48 h的过表达组和对照组SW620细胞,提取细胞总蛋白,采用BCA法测量细胞总蛋白浓度,然后在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶小孔内添加50 μg经过变性处理后的蛋白质,再进行浓缩胶层80 V恒压至样品在分离胶层压成一条线时,电压调至120 V,继续电泳,电泳后于冰水混合物中300 mA转膜2 h,丽春红染色10 min观察转移效果,随后在5%脱脂奶粉的摇床上孵育2 h;加入一抗(1∶500兔抗人p21多抗,1∶5000兔抗人GAPDH单抗)置于4℃孵育过夜;洗膜后加入羊抗兔IgG/HRP二抗(1∶2000),室温孵育1 h,采用增强化学发光法(enhanced chemiluminescence,ECL)显影得到蛋白印迹条带,采用Tanon软件分析条带灰度值,以β-actin为内参,相对定量结果以灰度值/光密度值表示.

1.4.7 双荧光素酶实验 取对数生长期的SW620细胞,调整细胞浓度为1X105/ml,接种于48孔板中,常规培养,待细胞汇合度至70%后,用于后续转染操作.将接种于48孔板的SW620细胞分为4组:A组,共转染pMIR-NC质粒和miRNA-95-3p;B组,共转染pMIR-p21质粒和miRNA-control组;C组,共转染pMIR-NC质粒和miRNA-control组;D组,共转染pMIR-p21质粒和miRNA-95-3p组;转染方法同"1.4.3",转染48 h后进行双荧光素酶报告实验.去除每孔内完全培养基,加入适量的报告基因细胞裂解液,而后每孔加入100 μl萤火虫荧光素酶检测缓冲液;采用多功能酶标仪检测孔内相对光单位(relative light unit,RLU),而后每孔加入海肾荧光素酶检测工作液后再次测定RLU.每孔荧光素酶活性相对值=萤火虫荧光素酶RLU/海肾荧光素酶RLU.

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软-件对数据进行分析.计量资料以均数±标准差()表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,多组组间两两比较比较采用SNK法.以P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 miRNA-95-3 p相对表达量的比较

实时荧光定量PCR分析结果显示:结肠癌组织中miRNA-95-3p的相对表达量为(2.57±0.26),明显高于癌旁正常肠黏膜组织的(1.00±0.24),差异有统计学意义(t=7.69,P<0.01).

2.2 SW620细胞增殖能力的比较

CCK-8法检测结果显示,过表达组SW620细胞的增殖能力为(1.38±0.24),明显高于对照组的(0.68±0.16),差异有统计学意义(t=4.20,P<0.01).

2.3 SW620细胞体外迁移能力的比较

过表达组SW620细胞的划痕区域相对宽度为(81.1±3.7)%,明显高于对照组的(47.6±7.3)%,差异有统计学意义(t=7.09,P<0.01).

2.4 转染后SW620细胞中 p21蛋白的相对表达量

Western blot检测结果显示:对照组SW620细胞中p21蛋白的相对表达量为(1.00±0.11),过表达组SW620细胞中p21蛋白的相对表达量为(0.64±0.19),过表达组SW620细胞中p21蛋白的相对表达量低于对照组,差异有统计学意义(t=2.84,P<0.05).

2.5 转染后SW620细胞荧光素酶活性的比较

双荧光素酶实验结果显示:4组SW620细胞的荧光素酶活性比较,差异有统计学意义(F=183.16,P<0.01).其中,B组、D组SW620细胞的荧光素酶活性均较C组和A组降低,差异均有统计学意义(P<0.05),A组SW620细胞的荧光素酶活性与C组比较,差异无统计学意义(P>0.05);B组SW620细胞的荧光素酶活性与D组比较,差异有统计学意义(P<0.05).(表1)

表1 转染后SW620细胞荧光素酶活性的比较(±s)

表1 转染后SW620细胞荧光素酶活性的比较(±s)

注:a与D组比较,P<0.05;b与C组比较,P<0.05;c与B组比较,P<0.05

指标荧光素酶活性5.43±0.09a c 3.71±0.18a b 5.82±0.15a c 2.84±0.26b A组B组C组D组

3 讨论

结肠癌是一种比较常见的恶性肿瘤,病死率较高[5].多数结肠癌患者被确诊时已处于中晚期,尽管目前针对结肠癌的治疗方法不断革新,包括了传统手术治疗以及放化疗在内的保守治疗等,但是各种治疗方法对于晚期结肠癌患者的治疗效果均不是很理想.由于结肠癌早期诊断方法的不完善,导致患者的最佳治疗时期被延误,多数结肠癌患者的术后5年生存率仍较低[12].因此,对结肠癌早期诊断方法的改革已经成为临床急需解决的关键难点.结肠癌的发生是一个多基因共同参与、多步骤完成的复杂生物学形成过程,这也提示需要从多种分子水平对其发生机制进行研究.通过对结肠癌发生机制的探索,有利于全面了解结肠癌的发生过程,进而有利于寻找新的治疗靶标[13].

目前,生命科学的研究已进入后基因组时代,人们对基因的研究首先转变成先了解基因序列,再通过逆基因手段抑制目标基因表达,最后才观察表型的变化,而miRNA则是目前的研究热点[14].相关研究显示,人体内超过30%～35%的蛋白质编码基因都受到了miRNA的调控,miRNA基本上影响了所有的分子信号转导通路[1].大多数的癌基因和抑癌基因均是miRNA的靶基因,因而在肿瘤中miRNA的靶基因可以作为抑癌基因下调原癌基因的活性,或者作为癌基因下调抑癌基因的活性[15-16].近年来,miRNA在结肠癌中的研究备受关注,因其特别的转录后调控方式,从而为结肠癌的研究提供了一类崭新的思路和方式.由于miRNA在结肠癌中的异常表达逐渐被发现,其部分的作用靶点和机制得以初步阐明[6-8,17].但是,miRNA在结肠癌中起到许多关键性的作用依旧未见报道.

已有研究表明,miRNA-95参与了肺癌、神经角质素瘤、肝癌等多种类型肿瘤的发生过程,其通过调控下游多种靶基因对肿瘤的发生、发展进行调节[8,10-11,18-20].近年来有相关报道指出,miRNA-95能进一步促进结肠癌的发生[8].在结肠癌的发展过程中,细胞周期遭到破坏是导致结肠癌细胞增殖的重要原因之一.细胞周期蛋白可以调控细胞周期,通过对细胞周期进行抑制,可以抑制各类肿瘤的发生.p21是由CDKN1A基因编码的一种蛋白质,已有研究表明,p21蛋白是细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDK)的抑制药[21-22],通过p21蛋白对CDK2和CDK4的活性进行抑制,从而抑制细胞周期进入S期[22].相关研究表明,miRNA-95-3p能抑制hepG2细胞中p21蛋白的表达,从而抑制肝癌细胞的增殖[19].

本研究对miRNA-95-3p与结肠癌的关系进行研究,结果发现结肠癌患者结肠癌组织中miRNA-95-3p的表达水平较癌旁正常肠黏膜组织明显升高.表明在结肠癌的发生发展过程中,miRNA-95-3p起到了实质性关键作用.为了更好地寻找结肠癌的诊断突破点,为结肠癌的治疗提供新的思路和靶点,本研究还对miRNA-95-3p的表达情况进行了进一步分析.为了能更深层次的研究miRNA-95-3p对结肠癌的影响,本研究对结肠癌SW620细胞进行转染,结果发现,转染miRNA-95-3p后能够明显提升SW620细胞的增殖及迁移能力.表明过表达miRNA-95-3p可以促进肿瘤细胞的增殖和迁移.为了研究miRNA-95-3p促进SW620细胞增殖及迁移的分子机制,本研究对SW620细胞进行转染,并检测p21蛋白的表达量.结果证实,转染miRNA-95-3p能够抑制SW620细胞中p21蛋白的表达.虽然该实验能确定p21与miRNA-95-3p的调控相关性,但是却不能鉴定miRNA-95-3p的靶位点.为了更进一步确定miRNA-95-3p在结肠癌中是否与p21的3'-UTR直接作用,本研究进行了双荧光素酶实验.目前,双荧光素酶实验是miRNA靶位点鉴定的常见的一种方法,该报告系统由两部分构成,分别是荧光素酶表达载体和包含目的miRNA靶基因3'-UTR克隆的荧火虫荧光素酶基因标记报告质粒;通过将表达载体和报告质粒同时转入细胞中表达,当细胞表达报告基因时荧光素酶激活表达载体,通过吸收光检测从而实现对目的miRNA靶位点的鉴定.如相对应基因的3'-UTR中含有miRNA的结合位点,则细胞内上调的miRNA将结合于靶基因3'-UTR,得以阻碍了萤火虫荧光素酶的翻译.当过表达miRNA-95-3p和含有p21的3'-UTR的双荧光素酶载体共转染SW620细胞时,萤火虫荧光素酶活性明显下降,验证了miRNA-95-3p在SW620细胞中是与p21的3'-UTR相结合.

综上所述,本研究验证了miRNA-95-3p在结肠癌组织中的异常表达,并且异常表达的miRNA-95-3p参与了结肠癌细胞的增殖、迁移及凋亡等生物学行为的改变,提示miRNA-95-3p与结肠癌进程的参与性.因此,miRNA-95-3p很有可能可以成为结肠癌基因治疗中的新靶点.从作用机制上来说,miRNA-95-3p可以直接结合单p21的3'-UTR区域对p21蛋白表达产生一定的影响,从而抑制结肠癌的进展.