陶涌 张玉霞 刘宇

孔雀石绿（malachite green，MG），又名碱性绿，是一种带有金属光泽的三苯甲烷类工业染料，常用来预防和治疗鱼类外部真菌和寄生虫感染，曾广泛应用于水产养殖业中。由于孔雀石绿具有潜在的致癌、致畸、致突变的作用，美国早在1993年已将孔雀石绿列为优先研究的致癌性化学物质，我国在农业行业标准《NY5071- 2002无公害食品鱼药使用准则》中也将孔雀石绿列为禁用药物。然而，由于没有低廉有效的替代品，孔雀石绿在水产养殖中的使用屡禁不止。目前国内外对孔雀石绿的检测多采用高效液相色谱、高效液相色谱-质谱联用等方法，这些方法检测过程繁琐，对检测仪器和检测人员要求较高，且需要对样品进行排除干扰和分离富集等复杂的前处理工作，不利于现场应用。孔雀石绿残留对自然系统和人类健康的潜在危险越来越受到人们的重视，对其进行有效跟踪、监测非常必要。因此，建立简便、快速的分析方法对孔雀石绿残留具有重要的意义。

本文结合分子印迹技术（Molecularly imprinted polymer，MIP）和固相微萃取技术（Solid- phase Microextraction，SPME）的优点，在MIP- SPME中引入电场作为新的作用力，发展了电吸附-分子印迹固相微萃取（EE- MIP- SPME）样品前处理联用技术。设计联用萃取技术装置，以自制的孔雀石绿（malachite green，MG）MIP- SPME涂层研究EE- MIP- SPME技术的萃取条件和萃取性能，建立MIPMG- SPME/HPLC联用分析方法，实现复杂生物、环境样品中孔雀石绿残留的痕量分析。

孔雀石绿（MG，分析纯），隐性孔雀石绿（LMG，分析纯）购于国药基团化学试剂有限公司。色谱纯乙腈和甲醇购自美国Sigam公司。商品化的固相微萃取纤维（100 μm，PDMS涂层）购自美国Supelco公司。

MIPPy- MWCNTs/Pt纤维制备及EE- MIPSPME实验在恒电位仪上完成。首先将抛光打磨后的Pt丝和不锈钢丝，插入多壁羧基碳纳米管（MWCNTs- COOH）的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）分散液中，Pt丝为正极，不锈钢丝为负极，施加35 V电压，Pt丝在溶液中停留大约5S后拔出。重复上述操作，以增加碳纳米管在Pt丝上的聚合厚度，最终将Pt丝放入红外干燥箱，干燥得到MWCNTs/Pt纤维。将制备好的纤维作为正极，不锈钢丝作为负极，饱和甘汞电极做参比电极，在吡咯-孔雀石绿（PPyMG，0.05 mol/L）混合溶液中进行电聚合反应。在0.95 V的电压下，聚合反应40min。在碳纳米管表面形成以孔雀石绿为模板分子的分子印迹聚吡咯纤维（MIPPy- MWCNTs/Pt）。

将MIPPy- MWCNTs/Pt纤维为工作电极、不锈钢丝为对电极、饱和甘汞电极为参比电极。于20mL小瓶中加入15mL不同浓度的MG溶液，在工作电极施加一定电压，搅拌下萃取。萃取完成后，纤维用400 μL的2%乙酸的甲醇-水溶液（v/v=8：2）解吸，取20 μL解吸液进行液相色谱分析。

色谱条件：在室温条件下进行，Zorbax XDB- C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm×5μm），流动相为醋酸/醋酸铵（50 mmol /L，pH为4.5）：乙腈=40：60 （V/V），流速1.0 mL/min，紫外检测波长608 nm，进样量为20 μL。

以自制孔雀石绿MIPPy- MWCNTs/Pt纤维研究了EE- MIP- SPME方法的萃取条件，如聚合物配方、施加电压、萃取时间、解吸溶剂和时间、萃取溶剂、盐浓度等。在电场作用下，吸附剂与吸附质之间的各种作用力得到增强，使得吸附剂的吸附能力增强。通过在SPME纤维上施加电压改善固定相的吸附特性，实现对目标物质的增强吸附。因此，施加电压的大小是影响萃取过程的关键因素。实验分别比较了在EE- MIP- SPME、MIP- SPME和SPME不同模式下对不同浓度MG的水溶液的萃取效率。结果如图1所示：EE- MIP- SPME、MIP- SPME的萃取量随着样品浓度的增加而增加，EE- MIP- SPME对MG具有更高的萃取能力，特别是在低浓度范围内具有更明显的促进作用。采用萃取时间为60 min，样品溶液1μmol/L，考察了施加电压对孔雀石绿MIP涂层萃取性能的影响。电压在0～0.8V时，随着电压的增加，孔雀石绿的萃取量逐渐增大；当电压超过0.8V以后，MG萃取量迅速降低，结果如图2所示。

为了验证所制备的孔雀石绿M IPPyMWCNTs/Pt萃取纤维的选择性吸附效果，实验选取孔雀石绿的結构类似物结晶紫（CV）和非结构类似物苏丹红II（Sudan II）两种对照物，同时用MIPPy- MWCNTs/Pt与NIPPy- MWCNTs/ Pt（非分子印迹吡咯聚合物）作为固相微萃取纤维，在最优萃取条件下，进行EE- MIP- SPME萃取实验。如图3所示，与 NIP 萃取纤维相比，MIP萃取纤维对MG及其结构类似物CV具有更高的萃取效率，这表明MIP萃取纤维对模板分子及其结构类似物具有很好的选择，而对非目标分子的识别较低。目标物质在 MIP 和NIP 萃取纤维上吸附能力的不同，可能是由于他们在孔径、形状及与分析物间功能基团之间的不同造成。

本实验方法在最优萃取条件下，通过EEMIP- SPME联用液相色谱（HPLC），对MG，CV混合水溶液的检出限和线性范围进行了考察。实验结果显示：在不同浓度水平上随着目标物浓度增加，EE- MIPPy- SPME对两种物质的吸附效率，在1- 500 μg/L范围内，均呈现较好的线性关系，相关系数r分别0.9996和0.9958，检出限为：MG 1.55 μg/L，CV 1.47 μg/L。

为了证实所建立的实验方法具有潜在应用价值，我们将该方法用于加标鱼池水和鱼肉样品中孔雀石绿残留的分析，图4显示的分别是自制MIP萃取纤维在SPME和EE- MIP- SPME模式下对加标鱼池水样萃取后得到色谱图。可以看出：采用MIP纤维SPME萃取，目标物峰高要比NIP纤维的高（图4c，4d）。图4e是在MIP纤维上施加直流电压后萃取得到的色谱图，得到的峰面积进一步增大。两种实际样品的加标回收率分别为87.7%- 108.7%和85.7%- 103.2%，相对标准偏差（RSD）为1.2% - 9.6%和4.6% -8.3%。实际样品中目标分子的高回收率和低干扰性，表明本实验建立的EE- MIP- SPME方法具有较高的选择性，以孔雀石绿为模板，自制的MIPPy- MWCNTs/Pt萃取纤维具有良好的吸附性能。欧盟法律规定动物源食品中孔雀石绿的残留量不得超过 2 μg/kg，因此本研究建立的方法能够适用于监测复杂食品样基质中痕量孔雀石绿残留的含量。

1： MG；2： CV；a：鱼池水样品直接进样；b：经商品化SPME萃取；c：经NIP纤维SPME萃取；d：经MIP纤维-SPME萃取；e：经EE-MIP-SPME萃取的加标样品

项目基金：湖南省食品药品监督管理局食品药品安全科技项目（湘食药科R201720）。