陆吉虎,张雪花,梅 梅,侯继波,唐应华*

(1.江苏省农业科学院动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏南京210014；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009)

随着禽类养殖集约化、规模化发展，疫病流行日趋复杂并使疫苗防控难度逐步加大。鸡新城疫(ND)、传染性支气管炎(IB)、减蛋综合征(EDS)和禽流感(AI)均是由病毒引起的鸡的传染病，在养鸡业中比较常见和多发，严重威胁着养鸡业的健康发展。目前生产中主要采用接种灭活的油乳剂联苗进行防控。但是随着疫苗的推广使用，病原也在不断发生变异，给防控工作带来了一定的困难。免疫增强剂能提高动物机体免疫系统功能，增强机体免疫力，如PolyI:C[1]、CpG[2,3]、LPS[4]、脂多糖、囊素五肽(BP5)、神经酰胺、咪喹莫特等多种动物天然免疫受体的激动剂在动物的免疫应答过程中都发挥着重要的作用。免疫增强剂MF59在人用流感疫苗中已经使用多年[5]，Intervet公司的猪圆环病毒疫苗和繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中都使用了DiluvacForte 佐剂[6]，Seppic公司的口蹄疫疫苗和新城疫疫苗分别添加使用了ISA206和ISA70佐剂[7]。

本试验室已经筛选获得可与疫苗配伍使用的系列复方免疫增强剂，并对该增强剂对禽流感疫苗以及禽用二联疫苗的免疫增强效果进行了评价[8-10]，本研究主要评价该免疫增强剂对禽用三联或四联灭活疫苗在海兰褐壳蛋鸡或罗曼蛋鸡上的免疫增强效果，扩大该免疫增强剂的适用范围。

1 材料与方法

1.1 疫苗、试验鸡及检测抗原等材料

鸡新城疫-传染性支气管炎-减蛋综合征-禽流感(H9亚型)四联油乳剂灭活疫苗(La Sota株+M41株+AV127株+HL株)(以下简称新-支-减-流四联疫苗或四联疫苗)，鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感(H9亚型)三联油乳剂灭活疫苗(La Sota株+M41株+HL株)(以下简称新-支-流三联疫苗或三联疫苗)，均为市售商品化疫苗。1日龄海兰褐壳蛋鸡和罗曼蛋鸡均购自江苏海安某孵化场，普通环境中饲养。鸡新城疫、禽流感(H9亚型)和减蛋综合征检测抗原均购自哈尔滨维科生物技术公司，传染性支气管炎(M41株)检测抗原购自荷兰GD公司。鸡新城疫F48E8株、禽流感(H9亚型)SD01株均为本实验室保存。ND、IB、EDS、AI(H9)阳性、阴性血清分别购自哈尔滨国生生物科技和哈尔滨威科生物技术公司。

1.2 含VA5免疫增强剂疫苗的配制

VA5免疫增强剂(以下简称VA5)为本实验室配制[8-9]。先将VA5与白油等按比例混合并充分乳化，然后与四联疫苗或三联疫苗按体积比为1∶9混匀即为含VA5免疫增强剂的疫苗。

1.3 VA5对四联疫苗的免疫效力增强试验

1.3.1 海兰褐壳蛋鸡免疫含VA5的四联疫苗试验 海兰褐壳蛋鸡饲养至10日龄分为3组(35只/组)，第1组免疫四联疫苗，第2组免疫含VA5的四联疫苗，第3组为生理盐水对照组。颈背部皮下注射，0.3 mL/只。免疫后第1、第2和第3周每组随机抽取5只鸡用PBS缓冲液(10 mL/只)冲洗喉气管，收集冲洗液；免疫后第2、第3和第4周每组随机抽取20只鸡采集翅静脉血并分离血清。分别检测上述冲洗液和血清针对新城疫(ND)、传支(IB)(M41株)、减蛋综合征(EDS)和禽流感(AI)(H9亚型)的血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)抗体效价(nlog2)(参照GB/T 16550-2008，新城疫诊断技术)，统计各组效价的几何平均值(Geometric mean titer，GMT)。

上述海兰褐壳蛋鸡免疫4周后分成2群，第1群(15只/组)用鸡新城疫F48E8株强毒肌肉注射0.2 mL/只(含1.0×105.0EID50)(egg infectious dose，EID50鸡胚半数感染剂量)，观察14 d，记录鸡发病死亡情况，统计攻毒保护率[(攻毒总鸡数-发病或死亡总数)/攻毒总鸡数×100]；第2群(15只/组)，以禽流感(H9亚型)SD01株(1.0×107.0EID50)进行滴鼻攻毒，攻毒后的第1、第3、第5和第7天采集试验鸡的喉气管、泄殖腔棉拭子。取每只鸡的2个拭子混合浸出液上清0.1 mL接种10日龄SPF鸡胚进行病毒分离，判定阳性率[10]。

1.3.2 罗曼蛋鸡免疫含VA5的四联疫苗试验 罗曼蛋鸡饲养至10日龄时分为3组(25只/组)，分别免疫四联疫苗、含VA5的四联疫苗和生理盐水。颈背部皮下注射，0.3 mL/只。免疫后第2、第3和第4周每组随机抽取20只鸡采集翅静脉血并分离血清，检测针对ND、IB、EDS、AI(H9亚型)的HI抗体效价。

1.4 VA5对三联疫苗的免疫效力增强试验

选择海兰褐壳蛋鸡的母源抗体(针对ND、IB、AI(H9亚型))HI效价≤2log2时进行免疫。试验鸡分为3组，每组20只。第1组免疫三联疫苗，第2组免疫含VA5的三联疫苗，第3组为生理盐水对照组。颈背部皮下注射，0.3 mL/只。免疫后第2、3、4周采集鸡翅静脉血分离血清，检测针对ND、IB、AI(H9亚型)的HI抗体效价，统计各组效价的几何平均值。

2 结果与分析

2.1 VA5免疫增强剂提高新-支-减-流四联疫苗对海兰褐壳蛋鸡的免疫效力

海兰褐壳蛋鸡免疫四联苗后，第2、第3和第4周含VA5免疫增强剂组血清针对鸡新城疫抗原的HI抗体效价均高于常规疫苗组，且第3、第4周HI抗体效价与常规疫苗组相比，均差异显著(P<0.05)(图1A)。可以看出，VA5可提高四联疫苗对ND的HI抗体效价。

图1 四联苗对海兰褐壳蛋鸡的免疫效力Fig.1 Efficacy of inactivated tetravalent vaccine (ND-IB-EDS-H9) in Hy-line brown laying hen breeds

用鸡传染性支气管炎抗原检测血清HI抗体效价。结果显示，免疫后第2、第3和第4周含VA5免疫增强剂组血清HI抗体效价均高于常规疫苗组，且第3、第4周血清HI抗体效价与常规疫苗组相比，差异显著(P<0.05)(图1B)。可以看出，VA5可提高四联疫苗对IB的HI抗体效价。

用鸡减蛋综合征抗原检测血清HI抗体效价。结果显示，免疫后第2、第3和第4周含VA5免疫增强剂组血清HI抗体效价均高于常规疫苗组。且第3、第4周血清效价与常规疫苗组相比，均差异显著(P<0.05)(图1C)。可以看出，VA5可提高四联疫苗对EDS的HI抗体效价。

用H9亚型禽流感抗原检测血清HI抗体效价，免疫后第2周含VA5免疫增强剂组的血清HI抗体效价高于7log2，常规疫苗组第3周的血清HI抗体效价达到7log2以上。含免疫增强剂免疫组第3、第4周血清HI抗体效价与常规疫苗组相比，均差异显著(P<0.05)(图1D)。可以看出，VA5可提高四联疫苗对H9的HI抗体效价。

用新城疫、传支(M41株)、减蛋综合征和禽流感(H9亚型)抗原分别检测免疫后鸡喉气管冲洗液的HI效价，结果显示免疫后第1、第2和第3周含VA5免疫增强剂组粘膜HI抗体效价均高于常规疫苗组，且第2、第3周含VA5免疫组针对ND、IB、EDS和AI(H9亚型)的粘膜HI抗体效价与常规苗组相比均差异极显著(P<0.01)(图2A、2B、2C、2D)。可以看出，VA5可提高四联疫苗对ND、IB、EDS和AI(H9亚型)的粘膜HI抗体效价。

图2 免疫四联疫苗的海兰褐壳蛋鸡的粘膜抗体效价Fig.2 Mucosal Antibody titers of inactivated tetravalent vaccine (ND-IB-EDS-H9) in Hy-line brown laying hen breeds

2.2 VA5免疫增强剂提高禽用新-支-减-流四联疫苗对NDV和H9亚型AIV的攻毒保护力

免疫4周后以鸡新城疫F48E8株强毒肌肉注射(1.0×105.0EID50)攻毒，结果显示生理盐水对照组全部死亡，四联疫苗免疫组有2只鸡出现精神不振、鸡冠发紫等发病症状，保护率为87%(13/15)，含VA5的四联疫苗免疫组无发病和死亡，保护率为100%(15/15)(表1)。由此可见，VA5免疫增强剂可以提高四联疫苗对鸡新城疫F48E8株的攻毒保护力。

以禽流感(H9亚型)SD01株进行滴鼻攻毒，检测鸡喉气管和泄殖腔棉拭子样品。含VA5免疫增强剂的试验组均未检测到病毒，而四联苗免疫组在攻毒后第5天仍有2只鸡检测到病毒(2/15)，空白对照组在第7天有5只鸡可以检测到病毒(5/15)(表1)。由此可见，VA5可以提高四联疫苗对禽流感(H9亚型)病毒的攻毒保护。

表1 蛋鸡免疫四联疫苗后NDV(IBV/ AIV)的攻毒保护率

dpc，攻毒后天数

dpc,days post challenge

2.3 VA5免疫增强剂提高禽用新-支-减-流四联疫苗对罗曼蛋鸡的免疫效力

分别用ND、IB、EDS、AI(H9亚型)的检测抗原检测罗曼蛋鸡免疫四联苗后第2周、第3周和第4周的血清，结果显示含VA5免疫增强剂组免疫后第3周、第4周血清针对ND、IB、EDS、AI(H9亚型)的HI抗体效价均高于四联疫苗免疫组并达到差异显著水平(P<0.05)(图3A、3B、3C、3D)。可以看出，VA5可提高四联疫苗对罗曼蛋鸡的免疫效力。

图3 四联疫苗对罗曼蛋鸡的免疫效力Fig.3 Efficacy of inactivated tetravalent vaccine (ND-IB-EDS-H9) in Lohmann laying hen breeds

2.4 VA5免疫增强剂提高新-支-流三联疫苗对海兰褐壳蛋鸡的免疫效力

海兰褐壳蛋鸡免疫三联疫苗后，含VA5免疫增强剂组第2、3、4周针对鸡新城疫抗原的血清HI抗体效价均高于常规疫苗组，且第3周和第4周血清效价与常规疫苗组相比，均差异显著(P<0.05)(图4A)。VA5提高三联疫苗在海兰褐蛋鸡上对ND的HI抗体效价。

免疫后第2、3、4周含VA5免疫增强剂组血清针对鸡传染性支气管炎抗原的HI抗体效价均高于三联疫苗组。且VA5免疫增强剂组第4周血清效价与三联疫苗组相比，差异显著(P<0.05)(图4B)。VA5能提高三联疫苗在海兰褐蛋鸡上对IB的HI抗体效价。

免疫后第2周含VA5免疫增强剂组的血清针对H9的HI抗体效价高于三联疫苗组且达7log2以上。含VA5免疫组第3、4周血清HI抗体效价与三联疫苗组相比，均差异极显著(P<0.01)(图4C)。VA5 提高三联苗在海兰褐蛋鸡上对AI(H9亚型)的HI抗体效价。

图4 三联疫苗对海兰褐壳蛋鸡的免疫效力Fig.4 Efficacy of inactivated trivalent vaccine (ND-IB-H9) in Hy-line brown laying hen breeds

3 讨论

VA5免疫增强剂包含咪喹莫特、PolyI:C、神经酰胺、胞壁酰二肽(MDP)等多种模式识别受体激动剂成分，并且不同单组分激动剂之间具有一定的协同效应，参与鸡体内的体液免疫和细胞免疫应答[11]，可以提高针对禽流感(H5 /H9亚型)的HI抗体效价、提高攻毒保护率并延长有效抗体持续期[8-9]；在新城疫-传染性法氏囊和新城疫-禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗中添加VA5同样可以提高该二联苗对鸡的免疫效力[10]。

生产中为了减少免疫应激，降低免疫成本并提高养殖综合效益，多联疫苗的使用将会逐步增多。本试验从体液免疫和攻毒保护率2个方面比较了含免疫增强剂的禽用三/四联灭活苗与常规疫苗对蛋鸡的免疫效果。VA5免疫增强剂与新-支-减-流四联疫苗或新-支-流三联疫苗共同免疫海兰褐壳蛋鸡以及VA5免疫增强剂与新-支-减-流四联疫苗共同免疫罗曼蛋鸡后能明显提升针对ND、IB、EDS和AI(H9亚型)的血清HI抗体滴度，且第3和4周血清抗体滴度与常规疫苗组相比差异均显著(P<0.05)。该结果与在禽流感(H9或H5亚型)灭活疫苗、禽用二联灭活疫苗(新城疫-法氏囊二联灭活疫苗和新城疫-禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗)中添加VA5免疫增强剂的免疫增强效果一致[8-11]。含VA5免疫增强剂组针对ND、IB、EDS和AI(H9亚型)的粘膜HI抗体效价也远高于不添加VA5的免疫对照组。这应该是VA5免疫增强剂中的咪喹莫特、PolyI:C等激动剂成分与巨噬细胞、树突状细胞等细胞表面的TLRs等受体结合后激活细胞，增强了机体的免疫应答[1,11-13]，从而诱导产生更高滴度的抗病毒抗体。毛光明等[14]发现在免疫新城疫疫苗前后同时注射PolyI:C可以明显提高血清中抗新城疫病毒抗体；Zhang等[15]把PolyI:C与PRRS灭活疫苗共同免疫动物也诱导产生高滴度的血清抗体。VA5中咪喹莫特、PolyI:C等不同单组分激动剂之间具有协同效应[11]，因此在疫苗中添加VA5较单一使用某种激动剂具有更好的免疫增强效果。另外VA5免疫增强剂也能够提高鸡外周血淋巴细胞增值，提高CD4+、CD8+T淋巴细胞的比例，并诱导IL-4和IFN-γ细胞因子分泌[11,16-17]，从而增强了机体的抗病毒感染的能力。因此在本试验中对免疫鸡用鸡新城疫强毒攻击，含VA5免疫增强剂组获得了100%的保护；用禽流感(H9亚型)SD01株攻毒后检测喉气管和泄殖腔棉拭子，含VA5免疫增强剂组均未检测到病毒，而四联苗免疫组在攻毒后第5天仍有鸡能检测到病毒。

以上结果表明，含VA5免疫增强剂的新-支-减-流四联疫苗(或新-支-流三联疫苗)免疫后比常规新-支-减-流四联疫苗(或新-支-流三联疫苗)能够使机体提前产生抗体且抗体效价高从而缩短免疫后保护空白期，并提高了攻毒保护率。VA5免疫增强剂不仅能够提高禽流感单苗、禽用新法二联苗和新流二联苗的免疫效力，对禽用新-支-减-流四联疫苗(或新-支-流三联疫苗)也具有同样的免疫增强作用，具有广阔的应用前景。