金美芳，林茂兹,3*，陈春香，雷晓玲

(1.福建师范大学福清分校近海流域环境测控治理福建省高校重点实验室，福建福清350300；2.福建师范大学福清分校海洋与生化工程学院，福建福清350300；3.武夷学院福建省生态产业绿色技术重点实验室，福建武夷山354300)

植物枯萎病一般由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)侵染引起[1]，是一种世界性土传真菌病害，其发病机理是：致病菌侵害茎基部维管束后，在维管束内繁殖蔓延，通过堵塞维管束导管和分泌有毒物质毒害寄主细胞，破坏寄主正常吸收输导机能，使寄主的养分水分转运受阻，最终造成植株枯死[2-4]。枯萎病在植株的全生育期均可发生，对生产造了成巨大损失，国内外已报道的被严重危害的作物有棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黄瓜、哈密瓜、西瓜、大豆、豇豆和太子参等[1-3]。植物枯萎病主要防治方法有培育抗性品种、化学试剂、采取农业措施、生物防治等方法。由于枯萎病由土传性真菌引起，情况复杂，用生物防治是一种较好的办法[2,4-6]。目前已报道用于防治尖孢镰刀菌引起枯萎病的主要有淡紫拟青霉菌(Paecilomyceslilacinus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilies)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)[2]、木霉菌(Trichoderma)[7-10]、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)[4-5,11-13]等。丛枝菌根真菌(ArbuscularMycorrhizalFungi)对防治尖孢镰刀菌引起的枯萎病也有较好的抑制作用[14]。盆栽试验表明，多粘类芽孢杆菌BRF-1和枯草芽孢杆菌BRF-2菌悬液及其无菌代谢物对黄瓜和番茄枯萎病不仅具有较好的防治效果，而且具有明显的促生作用[12]。生防菌EN5可以在其自然寄主番茄的根、茎及根际土壤中稳定定殖，有助于改善根际土壤微生态环境，抑制病菌繁殖[15]。研究尖孢镰刀菌引起的枯萎病生防菌对植物生长的影响，对生物菌肥开发，促进农业生产有重要的意义。

番茄(Lycopersiconesculentum)，别名西红柿、洋柿子，其果实营养丰富，可以生食、煮食、加工制成番茄酱、汁或整果罐藏，是全世界栽培最为普遍的果菜之一。番茄种植中番茄青枯病(枯萎病)是常见的病害之一，各地普遍发生，发病严重时造成植株青枯死亡，导致严重减产甚至绝收[11-13,15-18]。番茄病的生物防治效果及防治机理研究受到广泛关注[13,15-18]。本文以易感染尖孢镰刀菌引起枯萎病的番茄植株为材料，用前期筛选鉴定的多粘类芽孢杆菌S960[4-5]，在番茄幼苗期多次灌根，通过测定番茄植株的相关生长生理指标，研究生防菌S960对番茄生长的影响，为生物菌肥开发提供一定的理论和实践参考。

1 材料与方法

1.1 材料

多粘类芽孢杆菌S960：福建师范大学福清分校环境保护研究所保存。

番茄种子：以色列2012 F1号，购自济南沃尔富斯农业科技有限公司。

培养基：用牛肉膏蛋白胨培养基培养多粘类芽孢杆菌S960，配方为：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL、pH 7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 多粘类芽孢杆菌的培养 将S960菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基活化后，在无菌条件下将其接种于100 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于30 ℃摇床，振荡培养48 h，待细菌浓度达到108cfu/mL备用。

1.2.2 番茄的培养与处理 番茄的培养与处理在福建师范大学福清分校后山大棚中进行。将番茄种子播于营养土中(穴盘)，每穴1粒种子，正常管理，待番茄幼苗长到4～5片真叶时，取长势一致的幼苗120株移栽到含有营养土的花盆中，1周后，用自来水将多粘类芽孢杆菌稀释为0(3.55×108cfu/mL，T1)、0.5(7.1×107cfu/mL，T2)、10(3.55×107cfu/mL，T3)、50(7.1×106cfu/mL，T3)、100(3.55×106cfu/mL，T4)、500(7.1×105cfu/mL，T6)倍进行灌根处理。用自来水灌根作为空白对照(CK)。每个浓度排成1列，各处理15株，每隔1周灌根1次，连续灌根4次。试验期间保持常温(约25～30 ℃)，正常日照，正常湿度(60%～70%)。移栽1周后用1/4浓度的Hoagland营养液浇灌1次以补充营养。

1.2.3 指标测定 第4次灌根7 d后，对番茄进行各项指标测定。方法如下：

番茄生长指标测定：番茄的株高、枯萎高度占株高比例、茎周长、地上生物量(干质量)、根干质量等生长指标参考文献[19]的方法，每个指标测定重复5次。

光合作用指标的测定：用Ciras-2光合作用测定仪(美国，PP systems)测定番茄倒数第4片叶片的净光合速率(PN)、气孔导度(gs)、细胞间二氧化碳浓度(Ci)、蒸腾速率(E)等气体交换参数。每个处理随机重复10次测定。

叶绿素含量的测定：采样丙酮提取法[20]，提取液在645 nm、663 nm波长下用UV-1801紫外-可见分光光度计(北京，北分瑞利公司)测定吸光值。测定时，每个处理随机挑选3株番茄，分别取倒数第4片叶片各约1 g进行测定。

叶绿素荧光参数的测定：用Handy-PEA植物效率分析仪(英国，Hansatech)测定番茄倒数第4片叶片的PIabs、Fv/Fm、ABS/RC、TR0/RC、ET0/RC、DI0/RC、φP0、ψE0、φE0、DFabs等参数。每处理随机重复10次测定。每测定前活体植株叶片暗适应30 min。

取倒数第4片叶片，测定可溶性蛋白、可溶性糖和丙二醛含量。可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝染色法[21]测定，可溶性糖含量用蒽酮比色法[19]测定，丙二醛含量用硫代巴比妥酸显色法[19]测定，每处理重复3次测定。

1.3 数据处理

所得数据用SPSS 11.5进行处理，用one-way ANOVA单因素方差分析及多重比较(LSD)方法对数据进行分析，差异显著水平取α=0.05。

2 结果与分析

2.1 多粘类芽孢杆菌S960对番茄生长指标的影响

多粘类芽孢杆菌S960灌根可以增加番茄地上生物量、根干质量、株高和茎周长，且各指标的增加程度总体上与S960浓度有正相关关系，也可使番茄枯萎比例降低，且该指标与S960浓度总体上呈负相关关系(表1)。可见多粘类芽孢杆菌S960不仅对番茄生长有促进作用，且对番茄枯萎病有一定的防治效果。

表1 多粘类芽孢杆菌S960对番茄生长指标的影响

数值表示为：平均值±标准差，同一列不同的字母表示处理间差异显著(P<5%，LSD法比较)，n=5

Data shown as mean ± standard deviation,different letters in the same column indicate significantdifferences between treatments (P<5%,LSD compare),n=5

2.2 多粘类芽孢杆菌S960对番茄叶绿素含量的影响

不同的字母表示处理间差异显著(P<5%)，LSD比较，n=3Different letters indicate significantdifferences between treatments (P<5%,LSD compare),n=3图1 多粘类芽孢杆菌S960对番茄叶绿素含量的影响Fig.1 Effect of Paenibacillus polymyxa S960 on the chlorophyll content of tomato

植物叶绿素a/b的比值含量高低是对逆境适应的一种表现，叶绿素a/b的值降低意味着类囊体膜堆叠程度的降低，进而抑制了植物对光量子的有效吸收、传递和利用，使激发能不能迅速到达可利用的位置，从而降低光能转化为化学能的有效速率[22]。多粘类芽孢杆菌S960灌根可以显著(P<0.05)提高番茄叶绿素a含量，但未显著(P>0.05)影响番茄叶绿素b含量，多粘类芽孢杆菌S960灌根使叶绿素a/b的比值升高(图1)。

2.3 多粘类芽孢杆菌S960对番茄叶片气体交换常数的影响

气孔是植物叶片与外界进行气体交换的通道，其开度的大小对植物水分的吸收和CO2的同化有着重要的影响作用。一般随着气孔开度的减小，气孔阻力增加，蒸腾速率减小，CO2进入叶片受阻，光合速率下降[22-23]。随着多粘类芽孢杆菌S960灌根菌液浓度升高，番茄叶片PN、Ci，gs、E等指标都先升高后又降低，且在10倍稀释液(T3)达最高值(表2)。一定浓度的多粘类芽孢杆菌S960菌液灌根，提高了番茄气孔开度，使其胞间CO2浓度升高，其蒸腾速率也升高，但净光合速率也升高，这有利于番茄植株生物量积累，有利于植株生长(表2)。

表2 多粘类芽孢杆菌S960对番茄气体交换常数的影响

不同的字母表示处理间差异显著(P<5%)，LSD法比较，n=10

Different letters indicate significant differences between treatments (P<5%,LSD compare),n=10

2.4 多粘类芽孢杆菌S960对番茄叶片荧光动力学参数的影响

图2 多粘类芽孢杆菌S960对番茄叶片荧光动力学参数的影响Fig.2 Effect of Paenibacillus polymyxa S960 on the Chl a fluorescence of tomato

PIabs(光合性能指数)比Fv/Fm(最大PSⅡ的光能转换效率)能更灵敏地反映光合机构的变化[24]。用10倍稀释(T3)多粘类芽孢杆菌S960灌根后，番茄叶片的Fv/Fm未明显变化，而PIabs升高(图2)，这说明用多粘类芽孢杆菌S960灌根，可以提高番茄叶片光合同化作用。ABS/RC(单位反应中心吸收的光能)、TR0/RC(单位反应中心捕获的用于还原QA的能量)、ET0/RC(单位反应中心捕获的用于电子传递的能量)、DI0/RC(单位反应中心耗散的能量)、φP0(最大光化学效率)、ψE0(反应中心捕获的激子中用来推动电子传递到电子传递链中超过QA的其它电子受体的激子占用来推动QA还原激子的比率)、φE0(用于电子传递的量子产额)、DFabs(以吸收光能为基础的推动力)等指标均未发生明显变化(图2)。

2.5 多粘类芽孢杆菌S960对番茄叶片丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响

丙二醛含量可指示细胞膜脂过氧化程度，可溶性糖参与环境胁迫应答和信号传导过程，可溶性蛋白是重要的渗透调节物质和营养物质，可溶性蛋白含量的增加和积累能提高细胞的保水能力，对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用。各处理与对照(CK)比较，多粘类芽孢杆菌S960对番茄叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量均无显著(P>0.05)影响，但是丙二醛含量显著(P<0.05)降低(表3)。

表3 多粘类芽孢杆菌S960对番茄叶片丙二醛、可溶性蛋白和可溶性糖含量的影响

数值表示为：平均值±标准差，同一列不同的字母表示处理间差异显著(P<5%，LSD法比较)，n=3

Data shown as mean ± standard deviation,different letters in the same column indicate significantdifferences between treatments (P<5%,LSD compare),n=3

3 讨论与结论

多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)是芽孢杆菌科(Bacillaceae)类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的革兰氏阳性细菌，在划入类芽孢杆菌属之前又称Bacilluspolymyxa[25]。一些生防菌，同时具有防病促生作用[26-28]。多粘芽孢杆菌中某些菌株也是重要的植物生防细菌和植物根际促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)，植物根际促生菌通过定殖于植物根系，优先占领根际，可产生生长素、细胞分裂素等植物激素，促进植物生长，也可通过对植物病菌的抑制，间接促进植物生长，而且PGPR还可产铁载体等引起促生效果[29]。植物根际促生并非单纯的PGPR的促生作用，而是与植物、根际微生物以及土壤等相互协同发挥作用[29]。多粘类芽孢杆菌能分泌大量的活性物质，对许多细菌和真菌有抑菌活性，能提高植物的抗病能力，促进植物生长，提高产量[13,16]。其还可以通过与病原菌竞争生存空间和营养物质(生态位竞争)、对病害因素的解毒以及产生多种代谢产物达到抑制、杀死或者溶解病原的作用[30-31]。本研究结果(表1)与前述文献报道结果[26-28,30-31]一致，即多粘类芽孢杆菌S960具有防病促生作用。

植物的光合速率、蒸腾速率、叶绿素荧光参数、叶绿素含量、叶片可溶性蛋白、叶片可溶性糖等指标，直接或间接影响或表征作物的生长与生理过程。植物叶片中的光合色素参与光合作用过程中光能的吸收、传递和转换，光合色素含量直接影响植物光合能力，其中叶绿素与光合作用的关系最为密切，尤其是叶绿素a[21]。有研究表明：植物发生病害后叶片可溶性糖含量降低，可溶性蛋白含量升高，叶绿素含量降低，抑制叶片光合作用，一定程度上降低病害叶叶绿素荧光参数值和黄酮类化合物含量，从而降低叶片的品质，危害植物的生长[32]。叶绿素的合成受多种环境因素的影响，本研究结果(图1)说明在最适浓度下，多粘类芽孢杆菌S960促进了番茄光合机构的发育，引起生理机能的提高[22]。多粘类芽孢杆菌S960灌根可能会提高番茄将光能转化为化学能的有效速率。所以，多粘类芽孢杆菌S960灌根，能提高番茄叶片净光合速率(表2)，利于番茄植株生物量积累(表1)。本研究结果(表3)还说明多粘类芽孢杆菌S960灌根，可缓解番茄植株受病害胁迫下的细胞膜脂过氧化程度，起到保护植株的作用。

叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用，与“表观性”的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数更具有反映“内在性”特点，因此，该技术被称为测定叶片光合功能的快速、无损伤探针[33]。Handy-PEA对植物受环境胁迫或“负面”影响的叶绿素荧光指标较敏感，可以进行快速测定[24]。本研究应用Handy-PEA对番茄叶片荧光动力学参数进行测定，对叶绿素含量较高和光合速率较高的处理组(T3)与对照组进行比较，结果(图2)表明：多粘类芽孢杆菌S960对番茄Fv/Fm、ABS/RC、TR0/RC、ET0/RC、DI0/RC、φP0、ψE0、φE0、DFabs等指标均没有较明显的影响，但是PIabs明显提高。这在叶绿素a荧光动力学水平进一步验证了多粘类芽孢杆菌S960能促进番茄叶片光合速率，从而促进番茄生长，同时也验证了PIabs指标更敏感，可以更直接反应植物光合速率随环境因素变化的结论[23]。

另一方面，当外界环境条件变化时，植物体内叶绿素荧光的变化可以在一定程度上反映环境因子对植物的影响，逆境胁迫如缺铁或锰饥饿、高温、低温、盐胁迫及干旱胁迫等都能直接或间接地影响植物PSⅡ的功能[24]。但是多粘类芽孢杆菌S960灌根，促进番茄生长，尽管经多粘类芽孢杆菌S960促进作用，番茄叶片叶绿素a含量、净光合速率都有显著升高(表1、图1和表2)，经多粘类芽孢杆菌S960处理后的番茄叶片的叶绿素a荧光参数各指标均未显著(P>0.05)高于对照组。这可能说明大多数荧光动力学参数指标不适合应用在植物营养相关的领域。

多粘类芽孢杆菌S960灌根，可提高番茄叶片叶绿素含量，提高其净光合速率，促进植株生长，同时对防治枯萎病有一定效果。多粘类芽孢杆菌S960灌根，最适稀释倍数为10倍(3.55×107cfu/mL)。