张 健，张曼卡，马慧敏，宋心成，何玲玲，李 鑫,

1.北京大学地坛医院教学医院中西医结合中心，北京100015； 2.首都医科大学附属北京地坛医院中西医结合中心； 3.首都医科大学附属北京地坛医院传染病研究所

肝损伤已被认为是全球范围内严重的健康问题，可由病毒感染、肝毒性药物和有毒化学物质引起[1-3]。如果得不到及时有效的治疗，最终会发展成肝纤维化、肝癌甚至死亡。但目前临床上还没有针对急慢性肝损伤的有效治疗方法[4]。因此，探究肝损伤的发病机制，找到新的治疗靶点，为医师提供新的有效的治疗策略，提高肝损伤患者的生存率十分必要。

C6orf120基因编码N-糖基化蛋白质，其功能很大程度上未知。2009年大连大学肝脏糖蛋白质组差异分析发现[5]，该蛋白在人类肝组织内表达。我们课题组前期对该基因的重组蛋白也做了初步的功能研究。我们成功表达出C6orf120的重组蛋白，利用免疫组织化学技术分析结果显示，该基因表达的蛋白在肝组织中大量表达，在淋巴组织中也有表达，同时我们的前期工作证明该基因在肝损伤中发挥着一定的作用[6-7]。基因敲除技术是验证某一基因功能的金标准，因此，我们制备了C6orf120基因敲除大鼠，初步探索该基因在大鼠肝组织中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物C6orf120基因敲除大鼠由苏州赛业生物科技有限公司采用TALEN基因敲除技术制备，获得C6orf120+/-大鼠6只，其中雄性3只，雌性3只，饲养于北京大学医学部实验动物中心，饲养条件为无特定病原体(SPF)。温度控制在20～25 ℃，湿度(50±15)%，5只/笼，自由饮食和饮水，玉米芯垫料及饲料、饮用水均经过高温高压消毒灭菌处理。野生型(wild type,WT)大鼠全部购自北京大学医学部实验动物中心。

1.2实验试剂戊巴比妥钠(生理盐水配制成质量浓度为40 g/L)购自美国Promega公司；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和活化型半胱天冬酶-3(Cleaved caspase-3)多克隆抗体购自美国Abcam公司；GAPDH抗体购自美国Santa cruz公司；脱脂牛奶购自美国BD公司；qRT-PCR试剂盒购自北京全式金公司；PCR引物购自上海生物工程股份有限公司。

1.3主要仪器剪刀、镊子、止血钳、持针器购自上海医疗器械有限公司；7500 RT-PCR system购自美国ABI公司；琼脂糖电泳装置购自Bio-Rad公司；超声波破碎仪购自美国Branson公司。

1.4方法

1.4.1 动物分组：将WT大鼠作为对照组，C6orf120基因敲除(C6orf120-/-)大鼠作为实验组，每组8只，适应1周开始实验,实验前禁食12 h。

1.4.2 大鼠子代20 d称重：幼鼠由大鼠母乳喂养，产后20 d离乳并雌雄分笼。初期，合笼方式为雄性C6orf120+/-大鼠和雌性C6orf120+/-大鼠各1只(F1代)，得到F2代大鼠，得到C6orf120+/+、C6orf120+/-和C6orf120-/-3种基因型大鼠。后期雄性C6orf120-/-大鼠和雌性C6orf120-/-大鼠合笼得到大量纯合子大鼠。记录C6orf120 3种基因型大鼠及WT大鼠子代大鼠出生日期并于20 d时称重。

1.4.3 qRT-PCR分析TNF-α的mRNA变化：取0.2～0.3 g肝组织样品，用TRIzol法提取总RNA。在260 nm波长下测定样品总RNA浓度及纯度。将样本浓度稀释为500 ng/μl，严格按照逆转录盒(Takara)标准步骤将总RNA逆转录成cDNA，以2 μl cDNA为模板，使用7500 RT-PCR system进行扩增检测。 TNF-α和GAPDH 扩增条件为 50 ℃ 2 min ， 95 ℃ 10 min ， 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s ， 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s ，95℃ 30 s，60 ℃ 15 s，共 40个循环。GAPDH mRNA作为内参。TNF-α的上游引物序列：5′-GCGATGTGGAACTGGCAGAGG-3′，下游引物序列：5′-GCCACGAGCAGGAATGAGAAGAG-3′；GAPDH的上游引物序列：5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAAC-3′，下游引物序列：5′-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3′。

1.4.4 Western blotting检测TNF-α和Cleaved caspase-3的表达水平：随机处死年龄6～8 周的C6orf120-/-大鼠和WT大鼠各3只，留取大鼠的肝组织。取0.3～0.4 g肝组织样本于无菌EP管中，加入RIPA组织细胞快速裂解液和蛋白酶抑制剂，匀浆并用超声震荡裂解10 min，冰上裂解30 min；离心并吸取上清以获得总蛋白。蛋白变性后加到SDS-聚丙烯酰胺凝胶(体积百分比为12%)上进行电泳分离，将蛋白转移到膜上后用质量浓度为50 g/L的脱脂牛奶封闭1 h，在4 ℃条件下将硝酸纤维素膜与一抗孵育过夜，次日孵育二抗1 h，在曝光仪中，Tanon发光液显影，曝光。

2 结果

2.1C6orf120-/-大鼠的生长发育情况将F1大鼠进行合笼繁育，观察子代大鼠在生长发育过程中外观和行为活动的变化，结果发现，C6orf120-/-大鼠和WT大鼠在外观和行为活动上无明显差异。另外，我们对20 d的C6orf120-/-大鼠和WT大鼠进行称重，WT大鼠的体质量为(54.83±1.389)g，C6orf120-/-大鼠的体质量为(42.70±1.789)g，差异有统计学意义(P<0.0001)(见图1)。

图1 不同C6orf120基因型大鼠体质量的比较Fig 1 Comparison of body weight of different C6orf120 genotype rats

2.2基因C6orf120可能参与大鼠肝脏的炎症反应肝脏的损伤多与炎症反应紧密相关。我们课题组前期对该基因的重组蛋白也做了初步的功能研究[7]，利用免疫组织化学技术分析显示，该基因表达的蛋白在肝组织中大量表达，且在刀豆蛋白A(CON A)介导的免疫性肝损伤中发挥着重要作用。基因C6orf120在一定程度上可以抑制肝损伤过程中炎症因子的表达。为了研究该基因在大鼠肝脏炎症反应中的作用，我们首先在转录水平对肝组织中TNF-α表达情况进行检测，实验结果表明，与WT大鼠相比，C6orf120-/-大鼠肝组织中TNF-α表达明显升高，差异有统计学意义(P=0.008 3)。为了进一步验证，我们在蛋白水平对肝组织中TNF-α进行检测，结果显示，与WT大鼠相比，C6orf120-/-大鼠肝组织中TNF-α的表达水平明显升高，差异有统计学意义(P=0.0172)(见图2)。

图2 TNF-α在大鼠肝组织中的表达水平 A：大鼠肝组织中TNF-α在mRNA水平的变化；B：大鼠肝组织中TNF-α表达水平的

2.3基因C6orf120缺失会促进肝组织中Cleavedcaspase-3的表达Caspase-3蛋白是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族的成员，认为caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是细胞毒性T细胞(CTL)细胞杀伤机制的重要组成部分，caspase-3在细胞凋亡过程中起着不可替代的作用。为了验证该基因是否参与大鼠肝细胞凋亡过程，我们在蛋白水平对肝组织中Cleaved caspase-3进行检测，Western blotting结果表明，与WT大鼠相比，C6orf120-/-大鼠肝组织中Cleaved caspase-3的表达水平明显升高，差异有统计学意义(P=0.0301)(见图3)。

图3 蛋白Cleaved caspase-3在大鼠肝组织中的表达水平及灰度分析Fig 3 The expression of Cleaved caspase-3 in the liver tissues and Plots of pixel intensity

3 讨论

我们以上的实验结果表明，基因C6orf120的缺失会导致20 d大鼠体质量减轻，但是对于其外观及行为活动并没有明显的影响。C6orf120-/-大鼠肝组织中TNF-α及Cleaved caspase-3的表达水平明显升高。

肝脏是人和动物主要代谢的场所，时刻进行着重要的化学反应。同时，肝脏也是动物体内重要的合成器官和解毒场所[8]。肝脏是消化系统的重要组成部分，在人体的消化过程中还扮演着分泌胆汁、去氧化、存储糖原等角色。更为重要的是肝脏是人体内重要的药物转化与代谢的器官[9]，因此它也是很容易受损伤的脏器之一[10-12]。急性肝损伤多是由于病毒、细菌的感染，或者药物滥用引起的急性肝细胞损伤，如果得不到及时的治疗，很快就会发展成急性肝衰竭[13]。在我国每年因肝病死亡人数高达150万[14]。目前对于肝损伤还没有比较有效的治疗方法，临床上主要以内科治疗为主。因此，探究肝损伤的发病机制，找到新的治疗靶点，为医师提供新的有效的治疗策略，提高肝损伤患者的生存率十分必要。

C6orf120-/-大鼠在生长发育过程中体质量低于WT大鼠，提示该基因可能对大鼠的生长发育有一定的影响，其机制可能与脂代谢相关。多个其他基因敲除动物中也发现了体质量与野生型有差异的现象[15-16]，由于影响体质量的因素较多，其机制还需进一步实验进行验证。

C6orf120基因编码N-糖基化蛋白质，其功能很大程度上未知。我们的前期研究[6]结果表明，C6orf120蛋白在肝组织中大量表达。在功能上该基因与肝损伤具有密切的联系[17-19]。肿瘤坏死因子可分为TNF-α和TNF-β两种，前者来自单核巨噬细胞，后者由活化T细胞产生，具有调节细胞功能的作用[20]。TNF-α与机体炎症、免疫反应密切相关，且与疾病的活动性有关。大量TNF-α持续高表达会导致病变恶化，因此，在疾病的发展过程中具有重要作用[21]。实验性肝损伤动物常表现为 TNF-α升高，并与肝细胞坏死程度密切相关。在本实验中，与WT大鼠相比，TNF-α在C6orf120-/-大鼠肝组织中表达水平明显升高，说明基因C6orf120可能参与大鼠肝脏的炎症反应，提示该基因具有抑制炎症反应，保护机体正常功能的作用。

肝损伤的发生与肝细胞的凋亡有关，目前广泛认为外界刺激或细胞内在因素均可激活Caspase 级联反应引起凋亡[22-24]。上游的 Caspase 能依次激活下游的 Caspase ，形成Caspase 级联反应，将凋亡信号一级级传至底物，Caspase-3 则是这个过程的执行者[25-26]。活化的Caspase-3 可以切割不同底物，最终导致细胞凋亡，因此Caspase-3与细胞凋亡密切相关[27-28]。 在本实验中，Cleaved caspase-3的表达水平在C6orf120-/-大鼠肝组织中明显升高，说明基因C6orf120可能参与细胞的凋亡过程，抑制肝细胞的凋亡，对肝细胞具有一定的保护作用。另有文献[29]报道，TNF-α可与肝细胞膜上的TNFR1结合并形成TNFR-TRADD-FADD 复合物，该复合物可上调 Caspase 3 基因表达，进一步激活蛋白酶家族的级联反应，从而启动细胞凋亡途径。在本课题中，我们发现，基因C6orf120敲除会使大鼠肝组织中TNF-α和Cleaved caspase-3的表达水平明显升高，可能与TNFR-TRADD-FADD 复合物形成有关。还需要进一步实验验证。

综上所述，本研究提示C6orf120基因敲除对大鼠生长发育具有一定影响，该基因的缺失会促进细胞因子TNF-α和Cleaved caspase-3的表达，提示该基因可能对肝损伤具有一定的保护作用。