李 艳，徐智媛，程 宇，杨晋辉

昆明医科大学第二附属医院消化内科，云南 昆明 650101

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是临床较为常见的消化道恶性肿瘤之一，具有较高的发病率，据统计，2010年我国新增CRC患者约27万人，死亡患者超过10万人，近年来，CRC的发病率和死亡率均逐年增加，严重威胁着现代人类健康，是医疗界一大难题[1-2]。

CRC的常用治疗方法为手术切除肿瘤结合放射治疗、化疗药物治疗和中药治疗，取得了一定的治疗效果，但是治疗后易复发、转移，尤其易转移到肝脏，导致患者存活时间不长，因此，探讨CRC细胞的转移作用机制，进而寻找控制癌细胞转移的有效方法对治疗CRC具有重要价值[3-4]。

基质裂解蛋白和明胶酶B均能激活降解细胞外基质的胶原酶，引起癌细胞侵入到周围血管组织，进而发生转移[5-6]。激活素受体相互作用蛋白2(receptor interacting protein 2，RIP2)是具有多重功能的生长因子和分化因子，研究[7]表明，RIP2基因在脑神经瘤细胞系Neuro-2a细胞及肝癌细胞Hepal-6中有特异性表达，对肿瘤细胞的转移产生重要影响。但国内外关于RIP2基因在CRC患者肿瘤细胞转移过程中的作用机制研究较少，本文通过检测RIP2、基质裂解蛋白和明胶酶B在CRC患者中的表达情况，探讨RIP2在CRC侵袭、转移中的作用机制。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2015年12月至2016年11月来我院进行检查并确诊为CRC的124例患者(共计140例，排除16例)为研究对象，男68例，女56例，年龄(52.18±8.34)岁(32～74岁)。取其肿瘤组织作为实验组进行石蜡切片观察，并取距肿瘤组织周围5 cm处的正常组织作为对照组，进行石蜡切片观察。纳入标准[8]：根据诊断标准被确认为CRC的患者；患者的治疗方法为手术切除。排除标准：手术前使用过化疗药物；接受过放射治疗；不同意配合完成该实验者。

1.2实验材料人CRC细胞株HCT116购自上海远慕生物科技有限公司；RIP2抗体、基质裂解蛋白抗体、明胶酶B抗体购自北京普利莱(APPLYGEN)基因技术有限公司；免疫组织化学试剂盒购自华美生物工程有限公司；RPMI 1640完全培养液购自上海杰美基因医药科技有限公司；Hyclone胎牛血清、胰蛋白酶购自上海哈灵生物科技有限公司；siRNA、Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.3RIP2、基质裂解蛋白和明胶酶B的表达检测取CRC组织和正常组织的石蜡切片(厚度5 μm)，常规二甲苯梯度脱蜡，3% H2O237 ℃灭活10 min，于0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中进行抗原修复，用工作液37 ℃封闭10 min，加入一抗后4 ℃冰箱孵育过夜，冲洗后加二抗、辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液和DAB进行显色，脱水固封后进行镜检。

镜检计数方法：随机选择3个视野(400×)，利用IPP软件进行统计分析，以细胞浆呈现出棕黄色颗粒记为阳性，计算细胞总个数和阳性表达的细胞个数，取三次结果平均值，计算阳性表达率。阳性表达分级评分标准[9]：视野内阳性细胞数比例<25%记为0分，阳性表达率为25%～50%记为1分，阳性表达率为50%～75%记为2分，阳性表达率>75%记为3分[9]。

1.4RIP2基因的siRNA转染方法HCT116细胞株常规培养，并随机分为正常对照组、阴性对照组和RIP2抑制组，空白对照组只加转染试剂，并根据Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂盒方法，转染前1 d用质量浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶消化后，接种于6孔板上，转染时细胞密度约为2×105个/孔，分别用200 μl的无血清培养液稀释10 μl转染试剂和各组RNA，静置10 min后，转染试剂与各组混合，静置15 min后铺到6孔板，37 ℃、体积分数为5%的CO2继续培养48 h后进行检测。

1.5划痕实验检测细胞迁移能力取对数期HCT116细胞，质量浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶消化后计数，以4×104ml-1接种在24孔板上，常规培养，细胞贴壁生长后按照1.4方法分组处理，48 h后进行划痕处理，继续培养24 h后镜检，计算HCT116细胞的迁移距离。

1.6Westernblotting法检测RIP2、基质裂解蛋白、明胶酶B蛋白的含量转染实验进行48 h后，提取各组细胞的总蛋白，根据Bradford法对蛋白进行定量，分别取30 μg的HCT116细胞蛋白上样，采用质量浓度为120 g/L的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离后，转到硝酸纤维素膜上，使用质量浓度为50 g/L的脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃过夜，二抗室温1 h后，进行显色和吸光度计算。

1.7统计学方法采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计数资料比较采用秩和检验和χ2检验，计量资料比较采用t检验和Spearman相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组RIP2、基质裂解蛋白和明胶酶B蛋白的检测结果免疫组化结果显示，CRC组织(CRC组)中RIP2、基质裂解蛋白和明胶酶B蛋白的阳性表达率分别为69.35%(86/124)、74.19%(92/124)、61.29%(76/124)；在正常组织中(正常对照组)RIP2、基质裂解蛋白和明胶酶B的阳性表达率分别为30.65%(38/124)、35.48%(44/124)、38.71%(48/124)。秩和检验结果显示，RIP2、基质裂解蛋白和明胶酶B在CRC组的表达率明显高于正常对照组(P<0.05)(见表1)。

表1 RIP2、基质裂解蛋白和明胶酶B蛋白的表达Tab 1 Expressions of RIP2, matrix metalloproteinases and Gelatinase B

2.2RIP2蛋白表达与CRC转移的关系RIP2蛋白的表达与CRC细胞的浸润深度和淋巴结的转移情况具有相关性，RIP2蛋白表达阳性的CRC细胞浸润深度更大，且淋巴结的转移率更高(P<0.05)，但RIP2蛋白表达与其他生物学特征无相关性(P>0.05)(见表2)。

表2 CRC组织RIP2蛋白表达与病理参数的关系Tab 2 Relationship between RIP2 protein expression and pathological parameters in CRC tissues 比例/%

2.3RIP2-siRNA转染后RIP2、基质裂解蛋白和明胶酶B蛋白的表达结果显示，与阴性对照组和正常对照组相比，RIP2-siRNA转染组的RIP2蛋白表达量明显降低(P<0.05)；与阴性对照组相比，正常对照组RIP2蛋白的表达量差异无统计学意义(P>0.05)(见图1)。

与阴性对照组和正常对照组相比，RIP2-siRNA转染能够显著降低基质裂解蛋白、明胶酶B蛋白的表达(P<0.05)；与阴性对照组相比，正常对照组基质裂解蛋白和明胶酶B蛋白的表达量差异无统计学意义(P>0.05)(见图2)。

图1 RIP2-siRNA转染后RIP2蛋白的表达Fig 1 Expression of RIP2 after the transfection of RIP2-siRNA

图2 RIP2-siRNA转染后基质裂解蛋白、明胶酶B蛋白的表达Fig 2 Expression of matrilysin and Gelatinase B after RIP2-siRNA transfection

2.4RIP2的表达与基质裂解蛋白、明胶酶B蛋白的相关性相关性分析结果表明，CRC组织中RIP2蛋白的表达与基质裂解蛋白(r=0.412，P<0.01)和明胶酶B蛋白(r=0.408，P<0.01)的表达均呈正相关，且基质裂解蛋白与明胶酶B蛋白的表达呈正相关(r=0.432，P<0.01)。

2.5RIP2表达抑制后HCT116细胞迁移距离结果划痕实验结果表明，与阴性对照组和正常对照组相比，RIP2-siRNA转染能够显著降低HCT116细胞的迁移距离(P<0.05)，与阴性对照组相比，正常对照组HCT116细胞的迁移距离差异无统计学意义(P>0.05)(见图3)。

图3 RIP2-siRNA转染后HCT116细胞迁移能力变化 A：阴性对照组；B：正常对照组；C：RIP2-siRNA组Fig 3 The change of metastatic capability of HCT116 after the transfection of RIP2-siRNA A: negative control group; B: normal control group; C: RIP2-siRNA group

3 讨论

CRC是常见的消化道恶性肿瘤，发病率较高，居胃肠道肿瘤的第2位，且早期症状不明显，不易被发现。目前，手术切除肿瘤组织是治疗CRC最常用的方法，但易出现复发或肿瘤组织转移的情况，治疗结果难以达到预期效果。因此，研究CRC的发病机制，探索抑制CRC转移的方法至关重要。

近年来，关于抑制CRC细胞侵袭或转移的研究较多，有研究[10]发现，Gab2基因能够通过调控EMT以增强CRC细胞的侵袭及转移能力；CDKL1和Sam68也能够促进CRC细胞的增殖、侵袭及迁移能力，对CRC的发生和发展有重要影响；CTHRC1能够显著增加HT29细胞增殖、迁移及侵袭的水平[11]。而B细胞白血病/淋巴瘤6B(BCL6B)能够通过调节PI3K/AKT信号通路有效抑制CRC LoVo细胞的增殖和迁移[12]，由此可见，CRC细胞的迁移受多种基因共同影响，既有上调作用又有抑制作用，所以，探索关键基因是解决问题的关键。

激活素RIP2是多重功能的生长因子和分化因子，在癌细胞中表达异常，并具有抑制肿瘤细胞转移的相关报道[13]，但RIP2在CRC患者肿瘤细胞转移过程中的作用机制研究鲜见报道，因此，本文通过研究RIP2在HCT116细胞的表达和对细胞迁移的影响，结合其表达与癌细胞侵袭和转移过程中最常见、最关键的激酶基质金属蛋白酶-2(基质裂解蛋白)和基质金属蛋白酶9(明胶酶B)的关系，探索RIP2影响CRC HCT116细胞的作用机制。

结果表明，RIP2的表达与肿瘤细胞发展具有相关性，与正常对照组相比，RIP2蛋白的表达在HCT116细胞中显著增加，且RIP2的表达量与肿瘤细胞的浸润程度和淋巴结的转移情况具有相关性，肿瘤细胞浸润程度越高，淋巴结转移越严重，则RIP2蛋白的表达程度越高，即RIP2在肿瘤细胞的转移过程中发挥着积极作用。

在RIP2高表达的CRC组中，肿瘤细胞迁移的促进因子基质金属蛋白酶基质裂解蛋白和明胶酶B蛋白的表达也高于正常对照组，且RIP2在肿瘤细胞中的表达与基质裂解蛋白和明胶酶B蛋白表达呈正相关，由此推断，RIP2能够通过上调基质裂解蛋白和明胶酶B蛋白的表达，进而共同促进肿瘤细胞的转移。为增加实验的可信度，本研究利用RNAi技术，选择性抑制HCT116细胞内RIP2的表达，结果显示，RIP2的表达被抑制后，HCT116细胞的划痕明显，细胞迁移距离缩短，表明HCT116细胞的迁移能力明显减弱，而且HCT116细胞内基质裂解蛋白和明胶酶B蛋白的表达量也显著降低，由此进一步断定，CRC细胞HCT116内RIP2能够通过调节基质裂解蛋白和明胶酶B蛋白表达参与肿瘤细胞的迁移，即RIP2通过上调基质裂解蛋白和明胶酶B蛋白的表达，促进了CRC HCT116细胞的侵袭、转移。

综上所述，RIP2能够通过上调基质裂解蛋白和明胶酶B蛋白的表达，提高CRC肿瘤细胞的侵袭、转移能力，研究需进一步探索抑制RIP2的表达或阻断其调节基质裂解蛋白和明胶酶B蛋白表达的过程，达到抑制CRC细胞迁移的目的。