实验研究

刘 爽 高祥福 朱孝娟 刘会林 涂毅萍#

浙江中医药大学附属第三医院 浙江 杭州 310005

1 材料与方法

1.1 实验动物：健康雄性Wistar大鼠50只，体质量220±20g，购于浙江中医药大学动物实验中心，许可证号：SYXK（浙）2017-0015。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 药物与仪器：真武汤（炮附子、茯苓、白芍、生姜各9g，白术6g）由浙江中医药大学附属第三医院一次性选购。福辛普利（蒙诺）购于中美上海施贵宝制药有限公司，规格：10mg/片，批号：1705054。改良型RPMI-1640培养液、胎牛血清（FBS）、胰酶、PBS，均为HyClone 公司产品（美国），购自上海恒斐生物科技有限公司（北京）。2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐（细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒CCK-8）：日本同仁。25cm2一次性培养瓶、96孔板、24孔板：美国Corning公司。细胞级葡萄糖干粉：美国SIGMA公司。丙二醛（MDA）和过氧化氢酶（CAT）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。倒置相差显微镜（ZEISS公司，Vert.A1），超净工作台（北京王堂蓝翼科技有限公司，WT-IND），低速水平台式离心机（上海安亭科学仪器厂，TDL-4），二氧化碳培养箱（上海力申科学仪器有限公司，HF 151UV），电热恒温水浴锅（上海一恒科技仪器有限公司，HWS-24），紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司，UV754N），酶标仪（芬兰Labsystems公司，Multiskan 354）。

1.3 含药血清的制备：健康雄性Wistar大鼠50只，体重220±20g，适应性喂养1周后，随机分为5组，即正常对照组、西药对照组、真武汤低、中、高剂量组。真武汤低剂量组按18.9g/kg/d、真武汤中剂量组按37.8g/kg/d、真武汤高剂量组按75.6g/kg/d的真武汤灌胃给药，西药对照组按9mg/kg/d，正常组给予等体积生理盐水灌胃，每日1次，连续给药7d。在末次灌胃前8～12h禁食禁水，于第7d末次给药2h后采血，在无麻醉情况下（避免麻醉药对血药浓度和成分的影响）予以眼眶取血，3000rpm离心15min后取血清，56℃水浴30min灭活补体，经0.22μm孔径的针头滤器过滤除菌，分装-80℃冻存备用。

1.4 细胞培养：HMCs 7～10代，接种于含10%的FBS的RPMI-1640培养液的25cm2培养瓶中培养，培养箱环境37℃、含5%CO2、恒温。细胞培养至生长状态良好，至对数生长期时进行实验。

1.5 分组与给药：实验分6组，即正常对照组、高糖组、西药对照组、真武汤低、中、高剂量组。正常对照组予含10%正常大鼠血清的培养液培养干预，高糖组予含10%正常大鼠血清的高糖培养液培养干预，西药对照组予含10%福辛普利含药血清的高糖培养液培养干预，真武汤低剂量组（1组）予含10%真武汤低剂量含药血清的高糖培养液培养干预，真武汤中剂量组（2组）予含10%真武汤中剂量含药血清的高糖培养液培养干预，真武汤高剂量组（3组）予含10%真武汤高剂量含药血清的高糖培养液培养干预。

1.6 观察指标：分述如下。

1.6.1 各组HMCs的增殖情况：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，用培养液稀释为单个细胞悬液，以4×103/孔细胞密度接种于96孔培养板中，每孔加培养液100μl。将培养板置入CO2培养箱中。倒置显微镜下观察细胞，待细胞贴壁呈80%融合后改用无血清RPMI-1640培养液饥饿24h，使细胞生长同步化于G0期。按24h、48h、72h 3个时间点分组处理后，每孔加入CCK-8溶液10μl，37℃避光继续孵育4h后取出，采用酶标仪

在450nm波长处各孔测吸光度（A）值。

1.6.2 各组含药血清对HMCs活性氧（ROS）表达的影响：细胞接种于6孔板，每孔细胞数约1×105个/ml，于37℃、5%CO2培养箱中培养，用DCFH-DA标记结合流式细胞仪分别检测48h、72h的各组细胞的ROS水平。

1.6.3 各组含药血清对HMCs上清液中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活力和MDA含量的变化：将HMCs接种在24孔板中，细胞培养贴壁生长至70%，更换为10%血清的培养液同步24h，按实验分组换为不同的培养液（1ml），分别于刺激的48h和72h收集上清液，1500r/min，离心10min后待测，按试剂盒说明书进行SOD、GSH-PX活力和MDA含量的检测。

1.7 统计学方法：实验各组的数据以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析，多组数据之间采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用Dunnett检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HMCs不同时间点增殖情况比较：见表1。

2.2 各组含药血清对HMCs ROS表达的影响：见表2。

2.3 各组含药血清对人肾小球系膜细胞上清液中SOD、GSH-PX活力和MDA含量的影响：见表3。

表1 各组HMCs不同时间点增殖情况比较（±s）

表1 各组HMCs不同时间点增殖情况比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与高糖组比较，&P＜0.05，&&P＜0.01；与48h比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

正常组高糖组西药对照组真武汤1组真武汤2组真武汤3组0.334±0.086##0.658±0.109**##0.568±0.121**##0.628±0.101**##0.609±0.098**##0.510±0.056**&&##0.970±0.137 1.368±0.097**1.210±0.109**&&1.246±0.118**&1.216±0.117**&1.179±0.094**&&0.983±0.095 1.388±0.068**1.106±0.123**&
.201±0.050**&&1.144±0.068**&
.091±0.058*&&#

表2 不同处理因素对HMCs ROS表达的影响（±s）

表2 不同处理因素对HMCs ROS表达的影响（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与高糖组比较，&P＜0.05；与西药对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

正常组高糖组西药对照组真武汤1组真武汤2组真武汤3组6.45±0.62 27.15±1.99*13.48±1.10*&17.43±0.78*.13±1.40*&##10.48±1.05*.47±1.33 30.45±2.15*17.58±0.70*&20.15±1.71*.63±1.24*&##13.60±1.31*&#

表3 各组含药血清对SOD、GSH-PX活力和MDA含量的影响（±s）

表3 各组含药血清对SOD、GSH-PX活力和MDA含量的影响（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与高糖组比较，&P＜0.05，&&P＜0.01；与西药对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

正常组高糖组西药对照组真武汤1组真武汤2组真武汤3组10 10 10 10 10 10 1.756±0.131 0.732±0.041*1.439±0.147*&0.881±0.109*&
.386±0.122*&1.601±0.097**&##4.105±0.108 2.223±0.107*3.158±0.112*&2.727±0.195*.261±0.132*&3.442±0.112*.254±1.071 6.652±0.784*10.357±0.825*&7.704±0.673*&.241±0.748* .507±0.646*&16.365±0.982 9.682±0.636*13.710±0.614*&11.568±0.464*.850±0.530*&##14.563±0.618*&##1.003±0.064 3.411±0.113*1.731±0.098*&3.038±0.156*.017±0.104*
.613±0.080*&##1.200±0.092 4.114±0.086*1.821±0.082*&3.540±0.116*.216±0.112*
.669±0.057*&#

3 讨论

真武汤系《伤寒论》之方，用于治疗少阴病阳虚水泛及太阳病发汗伤阳，致阳虚水动诸症。全方温阳与利水并用且佐以敛阴之品，使之温热不伤阴，敛阴不助邪，被后世医家广泛应用于肾脏相关疾病的治疗。

HMCs是肾小球内最为活跃的细胞，其过度的增殖是导致肾小球硬化、肾脏纤维化的重要因素之一。研究发现，高浓度葡萄糖对HMCs的分泌功能、多元醇代谢、细胞基质合成等均有一定影响，而这与糖尿病肾病（DKD）早期高滤过的表现有关。本研究通过观察HMCs在高糖培养下不同时间点的增殖情况，发现HMCs的增殖在高糖培养下呈现双向过程。给予含药血清干预后发现，24h时，与高糖组比较，只有真武汤高剂量组对HMCs的增殖起到一定抑制作用，其余治疗组无效，而48h和72h时，西药对照组及真武汤低、中、高剂量组均出现对HMCs增殖的抑制作用，且有显著性差异。由此推断，真武汤对高糖培养下HMCs增殖的抑制作用有时间-效应依赖关系和剂量-效应依赖关系。可见，真武汤能通过抑制HMCs的增殖来保护肾脏，从而延缓DKD进展。至于具体途径，本研究选择了氧化应激的相关指标来进一步探索真武汤的作用机制。研究结果表明，真武汤具有抑制ROS生成的作用，进而减轻HMCs的氧化应激水平，同时，真武汤还能提高SOD和GSH-PX的活力，而这两个指标活性的增强意味着HMCs抗氧化能力的增强。此外，实验中MDA水平的降低，反映了细胞氧化应激水平的下调，以上都说明真武汤具有降低氧化应激水平的作用，从而发挥保护肾功能，防治DKD的功效。