张进忠，石 科,2，郭 丹，杨 亮，闫秀明

1．河南医学高等专科学校生物化学教研室，河南 郑州 451191；

2．郑州大学细胞生物研究室，河南 郑州450008

泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）是一个高度复杂的维持蛋白质平衡和细胞活性的体系，通过选择性周转目标底物来调节细胞内许多蛋白的稳定，因此UPS参与细胞的多种功能［1］，如细胞的增殖、凋亡、血管生成和运动，以及肿瘤的发生、发展［2］。

19S蛋白酶体中有4个去泛素化酶亚基，其中26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基7（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7，PSMD7）和26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基14（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 14，PSMD14）是JAMM家族的去泛素化酶，位于19S蛋白酶体中［3］。对完整的19S蛋白酶体组织结构学分析表明，在组成盖子亚复合体的9个亚基中，PSMD7位于中央核心部位，同时和其他4个亚基相结合［4］，说明PSMD7在形成19S蛋白酶体结构中起重要作用。PSMD7作为组成19S蛋白酶体结构中的核心成员是否参与肿瘤的发生、发展，以及其具体的分子机制尚不清楚。前期工作中，我们已经证实了PSMD7在食管鳞癌细胞EC9706和Eca109中呈高表达［5］。因此，本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测食管鳞癌及其癌旁正常组织标本中PSMD7的mRNA及蛋白表达情况。在食管鳞癌细胞TE-1中，用慢病毒介导的RNA干扰技术下调PSMD7的表达，观察细胞增殖及凋亡的变化，建立PSMD7表达量与肿瘤恶性程度之间的关系，为进一步确定PSMD7作为肿瘤治疗的靶点提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

TRIzol购自美国Invitrogen公司，RNA逆转录试剂盒和SYBR Green购自宝生物工程（大连）有限公司，蛋白提取试剂盒购自美国Solarbio公司，鼠抗人PSMD7单克隆抗体、鼠抗人GAPDH单克隆抗体和免疫组织化学SP试剂盒购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，Western blot相关试剂和JC-1线粒体膜电位检测试剂盒购自美国Solarbio公司，CCK-8试剂盒购自美国Beyotime Inst Biotech公司，Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒购自美国KeyGEN Biotech公司，细胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 标本来源

本研究所采用的30例标本均采自河南医学高等专科学校附属医院2016—2017年间未经放疗和化疗的食管鳞癌手术患者，其中男性17例，女性13 例，年龄35～72岁（平均52.4岁）。手术后立即将新鲜标本进行液氮冻存，每例标本均取癌组织及其癌旁组织（距原发灶边缘5 cm以上）。所有标本均经病理学检查确诊为食管鳞状细胞癌。

1.2 方法

1.2.1 RTFQ-PCR检测PSMD7的基因表达

采用TRIzol提取组织标本的总RNA，mRNA逆转录试剂盒合成cDNA，分别用PSMD7和GAPDH进行RTFQ-PCR检测。PSMD7引物：上游5’-CTGTCGTGAGCTGAGATC-3’；下游5’-TCTCAGATTCAAGTGATC-3’。GAPDH引物：上游5’-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3’；下游5’-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3’。反应体系20 μL，在实时荧光定量PCR仪器ABI Q7上设置如下反应条件：94 ℃预变性10 min，94 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸32 s，共30个循环，采用2－ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.2.2 Western blot检测PSMD7蛋白水平

提取临床食管鳞癌和癌旁正常食管组织标本的蛋白质，或离心收集细胞并提取总蛋白。检测细胞质中Cyt C的表达时，首先用细胞质蛋白提取试剂盒提取细胞质总蛋白，二辛可酸法（bicinchonininc acid，BCA）法测定蛋白浓度，每个标本取20 μg蛋白进行SDS-PAGE，电泳结束后进行湿转至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%脱脂奶粉对膜进行4 ℃过夜封闭，然后将膜与一抗（PSMD7单克隆抗体，1∶1 000；GAPDH单克隆抗体，1∶2 000；Cyt C单克隆抗体，1∶2 000；cleaved caspase 3单克隆抗体，1∶2 000；cleaved caspase 9单克隆抗体，1∶2 000；PARP单克隆抗体，1∶2 000；Bax单克隆抗体，1∶2 000；Bcl-2单克隆抗体，1∶2 000）4 ℃温育过夜，用TBST洗膜3次，每次5 min。再与辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶3 000）室温下温育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，用ECL发光液进行显影，计算相对灰度值表示蛋白的相对水平。

1.2.3 慢病毒介导的shRNA干扰PSMD7的表达与细胞增殖能力和凋亡的检测

本研究设计4条动力学参数较优的RNA干扰靶点，采用Scramble序列（5’-TTCTCCGAA CGTGTCACGT-3’）作为阴性对照（negative control，NC）。采用HEK-293T细胞进行慢病毒包装，收集病毒后用polybrene感染人食管鳞癌细胞系TE-1，转染72 h后用RTFQ-PCR和Western blot检测PSMD7的表达量。选择效率最高的RNA干扰靶点进行后续实验（表1）。

将干扰PSMD7表达慢病毒（PSMD7-LV-shRNA）和阴性对照慢病毒（NC-LV-shRNA）感染食管鳞癌细胞TE-1，然后用嘌呤霉素（puromycin）筛选阳性感染细胞，将细胞接种在96孔板上，培养至融合度达80%～90%，每孔加入10 µL CCK-8溶液，放入培养箱中继续培养，4 h后用酶标仪检测450 nm处的吸光度（D）值，计算抑制PSMD7表达后TE-1增殖能力的变化。

将慢病毒干扰的阳性细胞接种在6孔板上，培养至融合度达80%～90%，胰酶消化后加入Annexin Ⅴ-PE和7-AAD对细胞进行双染，采用流式细胞术测定细胞的凋亡情况。

表 1 PSMD7 shRNA靶点序列Tab. 1 Targeting sequence of PSMD7 shRNA

1.2.4 细胞线粒体膜电位的测定

采用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测未感染组、对照组和干扰组的线粒体膜电位。具体方法参照说明书，收集细胞，加入JC-1溶液混匀后置37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养15 min之后离心，离心速率为10 000×g，离心5 min收集细胞，加入2 mL膜电位检测缓冲溶液，混匀后离心弃上清液，再加入1 mL 膜电位检测缓冲溶液混匀，采用流式细胞术进行分析。红色荧光标记正常细胞线粒体，表示膜电位正常，绿色荧光标记凋亡细胞线粒体，表示膜电位降低。

1.2.5 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，其中两组之间的比较，每个样本数据用x±s表示，采用t检验分析，PSMD7蛋白表达和临床病理因素的相关性采用Spearman分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PSMD7在食管鳞癌组织中的表达

30例临床食管鳞癌和癌旁正常食管组织标本中PSMD7的mRNA表达量见图1A，73.3%（22/30）的标本中PSMD7的mRNA呈现高表达，且PSMD7 mRNA在食管鳞癌和癌旁正常食管组织标本中的表达差异有统计学意义（P＜0.05），说明大多数食管鳞癌组织中PSMD7的mRNA表达增高。

采用Western blot对食管鳞癌标本中PSMD7蛋白的表达进行检测，结果显示，70%（21/30）的食管鳞癌标本中PSMD7蛋白呈高表达，与癌旁正常组织相比，PSMD7在食管鳞癌组织中的表达显著升高（P＜0.05，图1B）。PSMD7蛋白的高表达与淋巴结转移呈正相关（P＜0.05），而与肿瘤分化程度和TNM分期无关（P＞0.05，表2）。

图 1 食管鳞癌组织中PSMD7的表达Fig. 1 Expression of PSMD7 in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and paracancerous tissues

表 2 PSMD7蛋白表达与食管鳞癌组织临床病理特征的相关性Tab. 2 The correlation of PSMD7 expression and ESCC clinical pathological characteristics

2.2 PSMD7表达水平对人食管鳞癌细胞系TE-1增殖能力和凋亡的影响

将PSMD7-LV-shRNA和NC-LV-shRNA感染人食管鳞癌细胞系TE-1后，用puromycin筛选阳性感染细胞（图2A～D）。设计的4种RNA慢病毒干扰序列都能显著降低PSMD7在TE-1中的表达，其中LV-3的敲减效率最高（图2E），因此选取LV-3进行后续实验。Western blot检测结果显示，筛选的PSMD7-LV-shRNA可以显著降低TE-1细胞中PSMD7蛋白的表达（图2F、G）。

图 2 慢病毒干扰TE-1细胞中PSMD7的表达Fig. 2 Lentiviral-mediated RNAi suppressed mRNA expression of PSMD7 in TE-1 cells

图 3 干扰TE-1细胞中PSMD7的表达抑制细胞增殖并促进细胞凋亡Fig. 3 Cell proliferation was decreased and apopotosis was induced when PSMD7 expression was inhibited in TE-1 cells

通过CCK-8方法检测干扰PSMD7的表达后TE-1细胞增殖能力的变化，结果显示，PSMD7干扰组的细胞增殖能力显著低于对照组（图3A），说明抑制PSMD7的表达可以降低TE-1细胞的增殖能力。流式细胞术检测细胞凋亡结果发现，PSMD7干扰组的细胞凋亡率为28.1%（3次取平均值），显著高于对照组和未转染组（图3B和3C），说明抑制PSMD7的表达可以诱导TE-1细胞的凋亡。

2.3 干扰PSMD7的表达对TE-1细胞线粒体膜电位和Cyt C的影响

细胞线粒体膜电位测定结果显示（图4A），未处理组TE-1细胞和对照组细胞的绿色荧光的比例为2.8%和3.1%，而PSMD7干扰组为37.5%，说明在TE-1细胞中抑制PSMD7的表达后线粒体的膜电位显著降低。我们用Western blot进一步检测了细胞质中Cyt C的表达，结果显示，与未处理组TE-1细胞和对照组相比，shRNA组细胞质中Cyt C的表达量显著升高（图4B和4C），说明抑制PSMD7的表达增加了线粒体膜的通透性，促进Cyt C从线粒体进入细胞质，表明PSMD7可能通过线粒体途径诱导TE-1细胞凋亡。

图 4 干扰PSMD7的表达对TE-1细胞线粒体膜电位和Cyt C的影响Fig. 4 Effects of PSMD7 inhibition on mitochondrial membrane potential and Cyt C expression in TE-1 cells

2.4 干扰PSMD7的表达对凋亡相关蛋白表达的影响

抑制PSMD7的表达后，我们检测了促细胞凋亡蛋白caspase-3、caspase-9和PARP的活性降解产物的表达，结果显示，与对照组相比，干扰组中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表达显著增高，其中cleaved caspase-3增加2.3倍，cleaved caspase-9增加2.0倍（图5A和5B）。此外，我们检测了凋亡标志物PARP的表达和裂解情况，PSMD7干扰组的PARP发生裂解，而未转染组和对照组未见PARP的裂解（图5C）。

促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2在细胞内的表达水平与线粒体膜的敏感性密切相关［6］。我们的研究表明，在TE-1细胞中抑制PSMD7的表达使线粒体膜电位增高，膜通透性增强，Cyt C从线粒体释放进入细胞质，我们进一步检测了这些变化是否影响Bax和Bcl-2在细胞内的表达。结果显示（图6），干扰PSMD7的表达后Bax的表达增高，Bcl-2的表达下降，与对照组相比，Bax/Bcl-2的比值增加了1倍左右，说明抑制PSMD7通过线粒体依赖的方式诱导细胞凋亡。

图 5 干扰PSMD7的表达对凋亡相关蛋白表达的影响Fig. 5 Effects of PSMD7 inhibition on the expression of apopotosis-related protein in TE-1

图 6 干扰PSMD7的表达对Bax和Bcl-2表达的影响Fig. 6 Effects of PSMD7 inhibition on the expressions of Bax and Bcl-2 in TE-1

2.5 Caspase抑制剂对PSMD7诱导TE-1细胞凋亡的影响

本研究采用Caspase抑制剂z-VAD-fmk处理TE-1细胞抑制Caspase的活性，结果显示（图7），z-VAD-fmk使干扰组的细胞活力从53%增加至84%，而抑制PSMD7引起的凋亡细胞从25.5%降为15.2%，差异有统计学意义（P＜0.05），进一步说明抑制PSMD7的表达诱导的细胞凋亡是通过线粒体依赖的方式进行的。

图 7 Caspase抑制剂对PSMD7诱导TE-1细胞增殖和凋亡的影响Fig. 7 Effect of caspase inhibitor on cell proliferation and induction of apopotosis after PSMD7 inhibition in TE-1 cells

3 讨 论

20S蛋白酶体的抑制剂硼替佐米被用来治疗多发性骨髓瘤和淋巴瘤，但易产生耐药，且对实体瘤的治疗效果差［7］。研究显示，19S蛋白酶体中的去泛素化酶参与肿瘤的发生、发展并可以作为肿瘤治疗的靶点，如一些去泛素化酶对肿瘤细胞活力是必需的，通过改变凋亡因子的表达来促进细胞的生存，它们的表达和肿瘤的恶性程度相关［8］。在本研究的前期工作中，我们已经证实PSMD7在食管鳞癌细胞EC9706和Eca109中高表达，且定位发生改变。慢病毒介导的shRNA干扰PSMD7的表达可以降低食管鳞癌细胞的蛋白酶体活性，使泛素化蛋白在细胞内发生聚集［5］。本研究以临床采集的肿瘤标本为研究对象，发现73.3%的标本中PSMD7的mRNA呈高表达，70%的标本中PSMD7蛋白呈高表达，并且其高表达与淋巴结转移呈正相关，而与肿瘤的分化程度和TNM分期无关。这些结果表明PSMD7的过表达在食管癌发生、发展中可能起着重要的作用，因此我们对PSMD7在食管癌发生、发展中的作用机制进行了深入的研究。

研究显示，shRNA干扰PSMD7的表达增加了依赖泛素的GFP报告基因的荧光强度，并导致细胞死亡，和蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞得到的结果类似［9］。本研究用慢病毒介导的RNA干扰来抑制TE-1细胞中PSMD7的表达，发现使细胞的增殖能力下降并且诱导了细胞的凋亡，这些现象和蛋白酶体抑制剂的作用类似。对PSMD7的结构分析显示，JAMM结构域是一个非金属的无等位酶活性的结构［10］，说明PSMD7可能不直接水解多泛素化蛋白链。然而PSMD7却同时和其他4个亚基相结合，并位于中央核心部位［4］，说明PSMD7在形成19S蛋白酶体lid结构中起重要作用。因此抑制PSMD7的表达有可能影响19S蛋白酶体的组装，并影响其识别和水解多泛素化链的功能。我们的前期研究已表明，抑制食管鳞癌细胞中PSMD7的表达使细胞内泛素化蛋白增加，泛素的荧光增强，并且蛋白酶体的活性降低［5］，说明PSMD7参与维持蛋白酶体的正常功能，因此在TE-1细胞中抑制PSMD7的表达得到了类似抑制蛋白酶体活性的结果。

线粒体是细胞的能量工厂，是参与细胞凋亡的重要细胞器，在凋亡早期即出现结构和功能的改变。在外界因子的刺激下，细胞内首先会发生线粒体膜通透性增加，体现在膜电位下降，使Cyt C释放进入细胞质，激活一系列caspase级联反应，从而引起细胞核发生凋亡。促凋亡因子Bax可以插入线粒体外膜上诱发线粒体导致的细胞凋亡，抗凋亡因子Bcl-2通过稳定线粒体膜电位的方式使细胞避免进入凋亡通路［11］。本研究抑制PSMD7的表达后观察到细胞增殖能力下降并诱导细胞凋亡，接着我们研究了这种凋亡是否通过线粒体依赖的方式进行。结果发现，抑制PSMD7的表达后TE-1细胞的线粒体膜电位显著降低，细胞质中Cyt C的表达量显著升高，说明抑制PSMD7的表达增加了线粒体膜的通透性，并促进Cyt C从线粒体进入细胞质。此外，PSMD7干扰组中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表达显著增高，凋亡标志物PARP发生裂解，而未转染组和对照组未见PARP的裂解。干扰PSMD7的表达后，Bax的表达增高，Bcl-2的表达下降，与对照组相比，Bax/Bcl-2的比值增加了1倍，说明PSMD7通过线粒体途径诱导TE-1细胞凋亡。Caspase抑制剂z-VAD-fmk使干扰组的细胞活力恢复，而抑制细胞的凋亡，进一步说明抑制PSMD7的表达诱导的细胞凋亡是通过线粒体依赖的方式进行的。

本实验结果表明，PSMD7在食管鳞癌标本中呈高表达，参与了食管癌的发生、发展。进一步的机制研究表明，抑制PSMD7使TE-1细胞的增殖能力下降，并诱导细胞凋亡，其机制是以线粒体依赖的方式进行的。本研究为进一步确定PSMD7作为食管鳞癌治疗的靶点提供了依据。