史小映,姜 茹

(1西安市第一医院心血管科,西安 710002;2空军军医大学药学系药物化学教研室;*通讯作者,E-mail:jiangru@fmmu.edu.cn)

丹参素,其化学名称为R-(+)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸,是唇形科鼠尾属植物丹参根部水提液中分离得到的一种有效成分。丹参素具有改善微循环[1]、抗菌消炎[2]、抗自由基氧化[3]等广泛的药理作用,因此在治疗心血管疾病、心律失常等方面拥有广泛的开发前景。然而,由于丹参素水溶性很强,难于透过细胞膜的脂质双分子层,导致其口服用药时生物利用度低,同时在体内的半衰期很短,极大地限制了丹参素的临床应用。前期的复方丹参滴丸药代动力学研究表明[4],丹参素异丙酯是一种具有脂溶性的活性代谢产物,有利于克服其口服生物利用度低、半衰期短等缺点,为新的化学原料药开发提供基础。

随着科学技术的不断发展及人类认知能力的不断提高,对于手性药物的开发和应用已经越来越广泛[5]。手性药物由于其空间构型不同与生物体内受体蛋白之间的匹配和识别也产生较大差异,可以形象地表示为“锁钥”的关系,往往是一种对映体分子具有较强的生理活性,另一种对映体无活性或活性很低,有些甚至产生相反的生理作用[6]。现阶段,手性药物开发有天然产物提取、外消旋体拆分、生物催化合成及不对称合成等途径,由于前三种方法均有产率较低、成本昂贵等劣势,而手性药物的不对称合成法具有效率较高、生产成本可控、生产容量大且有利于分离提纯等优势,是一种有望实现工业化的新技术。

丹参素异丙酯作为一种手性化合物,其手性中心在2-位C原子上。Chen等[7]利用经典的Sharpless不对称双羟化反应构建手性中心,建立了丹参素异丙酯的不对称合成路线,其对映选择性为97.8%。本文针对该工艺路线进行了优化改进,通过用Et3SiH及CF3COOH建立了高区域选择性和空间构型高度保持的选择性脱氧新方法,并在常温常压条件下催化加氢,使丹参素异丙酯的对映选择性由97.8%提高至接近100%,为手性丹参素异丙酯开发了一条简便高效的优化合成路线。

1 材料与仪器

1.1 原料与试剂

3,4-二羟基苯甲醛为南京天尊试剂有限公司购买;奎宁及奎尼丁由国药集团化学试剂有限公司购买;锇酸钾(K2OsO4·2H2O)及甲基磺酰胺(CH3SO2NH2)为Alfa Aesar试剂有限公司产品;三乙氧基硅烷(Et3SiH)和三氟乙酸(CF3COOH)为阿拉丁试剂有限公司购买;配体(QN)2PHAL及(QD)2PHAL自制[8];其他常规试剂和溶剂均为国产分析纯或化学纯。

1.2 实验仪器

XRC-1显微熔点仪;PERKIN-ELMER 343型自动旋光仪;Bruker ARX-500型核磁共振波谱仪;Bruker ZAB-HS型质谱仪;高效液相色谱仪为戴安DIONEX P680型;手性色谱柱为Daicel Chiral AD-H。

2 方法与结果

丹参素异丙酯优化的不对称合成方法以3,4-二羟基苯甲醛为起始原料,通过苄氧基保护得到3,4-二苄氧基苯甲醛,其后经过Knoevenagel缩合和酯化反应生成(E)-3-(3,4-二苄氧基苯基)丙烯酸异丙酯,使用本实验室合成手性催化剂,采用Sharpless不对称双羟化反应构建手性中心得到3-(3,4-二苄氧基苯基)-2,3-二羟基丙酸异丙酯,随后在Et3SiH和CF3COOH条件下,选择性脱羟基得到3-(3,4-二苄氧基苯基)-2-羟基丙酸异丙酯,最后,常温常压条件下Pd/C催化加氢得到高光学纯度的产物手性丹参素异丙酯(见图1)。

图1 手性丹参素异丙酯不对称合成优化路线Figure 1 Modified synthetic route of the chiral Danshensu isopropanol ester

2.1 3,4-二苄氧基苯甲醛的合成

在氮气保护条件下将3,4-二羟基苯甲醛(24.9 g,0.18 mol)、碳酸钾(124.2 g,0.9 mol)和新制的苄基氯(52 ml,0.45 mol)加入1 000 ml反应瓶中,随后加入360 ml无水N,N-二甲基甲酰胺,油浴条件下75 ℃反应4 h。反应液经过抽滤,滤液减压蒸出溶剂N,N-二甲基甲酰胺,产物趁热倒入有冰水的烧杯中,可在烧杯底部快速形成硬块状固体。将固体研磨后,用新鲜N,N-二甲基甲酰胺彻底洗净,抽滤,水洗3次,真空烘干,得3,4-二苄氧基苯甲醛为淡黄色粉末状产物54.6 g,收率95%。熔点90-91 ℃。

2.2 (E)-3-(3,4-二苄氧基苯基)丙烯酸异丙酯的合成

将3,4-二苄氧基苯甲醛(54.0 g,0.17 mol)、丙二酸(52.9 g,0.51 mol)加入1 L单口瓶,270 ml二氧六环作为溶剂,吡啶和哌啶共9 ml作为催化剂,吡啶与哌啶体积比为2 ∶1,搅拌加热回流4 h。反应液冷却至室温,将反应液倒入含有少量盐酸的冰水中,烧杯中立即出现大量白色沉淀。过滤沉淀,水洗3次,真空干燥得(E)-3-(3,4-二苄氧基苯基)丙烯酸为白色粉末状产物59.0 g,收率96%。熔点201-202 ℃,1H-NMR(500 MHz,CDCl3):δ 7.67-7.63(d,J=15.85 Hz,1H),7.46-7.43(m,4H),7.39-7.36(m,4H),7.33-7.30(m,2H),7.14-7.13(d,J=1.95 Hz,1H),7.10-7.08(dd,J1=1.9 Hz,J2=2.0 Hz,1H),6.94-6.92(d,J=8.35 Hz,1H),6.25-6.22(d,J=15.85 Hz,1H),5.21-5.19(d,J=10.6 Hz,4H);HRMS:C23H20O4[M+H+]361.139 5。

将(E)-3-(3,4-二苄氧基苯基)丙烯酸(36.0 g,0.10 mol)、550 ml异丙醇加入1 L烧瓶中,10 ml浓硫酸为酯化反应的催化剂,油浴中105 ℃加热回流24 h,停止反应,反应液自然冷却析出晶体,沉淀用冰水洗涤3次,真空干燥,得(E)-3-(3,4-二苄氧基苯基)丙烯酸异丙酯为白色粉末状固体33.0 g,产率82%,熔点114-115 ℃,1H-NMR(500 MHz,CDCl3):δ 7.59-7.55(d,J=16 Hz,1H),7.49-7.45(m,5H),7.41-7.35(m,5H),7.14(s,1H),7.10-7.08(d,J=8.4 Hz,1H),6.95-6.93(d,J=8.4 Hz,1H),6.27-6.23(d,J=15.6 Hz,1H),5.22-5.20(d,J=8.8 Hz,4H),5.16-5.11(m,1H),1.33-1.32(d,J=6.4 Hz,6H);HRMS:C26H26O4[M+H+]403.186 5。

2.3 (2R,3S)-3-(3,4-二苄氧基苯基)-2,3-二羟基丙酸异丙酯的合成

将铁氰化钾(9.90 g,30 mmol)、碳酸钾(4.10 g,30 mmol)、配体(QN)2PHAL(0.078 g,0.1 mmol)、锇酸钾(0.007 4 g,0.02 mmol)及甲基磺酰胺(0.95 g,10 mmol)混合加入250 ml三口瓶中,100 ml叔丁醇-水(体积比1 ∶1)作为溶剂,充分搅拌。室温下将(E)-3-(3,4-二苄氧基苯基)丙烯酸异丙酯(4.02 g,10 mmol)加入反应液中,机械搅拌反应38 h,体系颜色由淡黄色溶液变为黄绿色溶液。加入15 g亚硫酸钠,继续搅拌60 min,抽滤,滤液用乙酸乙酯(3×40 ml)冲洗,合并有机相,无水硫酸镁干燥12 h。过滤后旋蒸。粗产品经柱色谱纯化得(2R,3S)-3-(3,4-二苄氧基苯基)-2,3-二羟基丙酸异丙酯为白色固体3.35 g,产率77%,熔点107-107.5 ℃,[α]D25=-2.0°(c1,MeOH);1H-NMR(500 MHz,CDCl3):δ 7.49-7.45(m,5H),7.41-7.36(m,5H),7.09(s,1H);6.93(d,J=8.0 Hz,2H),5.19-5.18(d,J=8.8 Hz,4H),5.14-5.06(m,1H),4.88-4.86(m,1H);4.28-4.26(m,1H),3.14-3.12(d,J=6.0 Hz,1H),2.75-2.73(d,J=6.4 Hz,1H),1.28-1.26(d,J=6.4 Hz,3H),1.21-1.20(d,J=6.0 Hz,3H);HRMS:C26H31NO6[M+NH4+]454.218 4。HPLC分离条件:Daicel Chiral AD-H柱;正己烷 ∶异丙醇=90 ∶10;流速:1.0 ml/min;检测波长:237 nm;保留时间为88.7 min[7],ee>99.9%。

2.4 (2S,3R)-3-(3,4-二苄氧基苯基)-2,3-二羟基丙酸异丙酯的合成

用配体(QD)2PHAL代替(QN)2PHAL,其余操作同1.2.3节,得(2S,3R)-3-(3,4-二苄氧基苯基)-2,3-二羟基丙酸异丙酯为白色固体2.87 g,产率65%,熔点107.2-107.8 ℃,[α]D25=+2.0°(c1, MeOH);1H-NMR(500 MHz,CDCl3):δ 7.49-7.45(m,5H),7.41-7.36(m,5H),7.09(s,1H);6.93(d,J=8.0 Hz,2H),5.19-5.18(d,J=8.8 Hz,4H),5.14-5.06(m,1H),4.88-4.86(m,1H);4.28-4.26(m,1H),3.14-3.12(d,J=6.0 Hz,1H),2.75-2.73(d,J=6.4 Hz,1H),1.28-1.26(d,J=6.4 Hz,3H),1.21-1.20(d,3H);HRMS:C26H31NO6[M+NH4+]454.218 4。HPLC分离条件:Daicel Chiral AD-H柱;正己烷 ∶异丙醇=90 ∶10;流速:1.0 ml/min;检测波长:237 nm;保留时间为62.1 min[7],ee>99.9%。

2.5 (2R,3S)-3-(3,4-二苄氧基苯基)-2-羟基丙酸异丙酯的合成

将(2R,3S)-3-(3,4-二苄氧基苯基)-2,3-二羟基丙酸异丙酯(0.87 g,2.0 mmol)和20 ml无水二氯甲烷加入100 ml三口瓶中。氮气气氛下,依次加入三乙氧基硅烷(1.0 ml,6.0 mmol)、三氟乙酸(1.5 ml,20 mmol),在冰浴中反应2 h,然后自然升温至室温反应12 h,并用20 ml饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应,乙酸乙酯萃取3次(3×20 ml),萃取液用饱和食盐水洗涤至近中性,无水硫酸镁干燥12 h,过滤,滤液旋蒸,得粗产物为淡黄色油状物。粗产物经柱色谱纯化得(2R)-3-(3,4-二苄氧基苯基)-2-羟基丙酸异丙酯为白色固体0.7 g,产率83%,熔点64.3-65 ℃,[α]D25=+24.3°(c1,CH3CH2OH),1H-NMR(500 MHz,CDCl3):δ 1.21(m,6H),2.84(d,1H),3.00(d,1H),4.32(s,1H),5.02(d,1H),5.12(s,4H),6.71-6.86(m,3H),7.25-7.44(m,10H)。HPLC分离条件:Daicel Chiral AD-H柱;正己烷 ∶异丙醇=85 ∶15;流速:1.0 ml/min;检测波长:237 nm,保留时间为32.5 min(见图2),ee>99.9%。

图2 (2R)-3-(3,4-二苄氧基苯基)-2-羟基丙酸异丙酯的高效液相色谱图Figure 2 HPLC of isopropyl (2R)-3-(3,4-dibenzyloxyphenyl)-2-hydroxypropanoate

2.6 (2S,3R)-3-(3,4-二苄氧基苯基)-2-羟基丙酸异丙酯的合成

在100 ml三口瓶中加入(2S,3R)-3-(3,4-二苄氧基苯基)-2,3-二羟基丙酸异丙酯(0.87 g,2.0 mmol),其余操作同1.2.5,得(2S)-3-(3,4-二苄氧基苯基)-2-羟基丙酸异丙酯为白色固体0.60 g,产率72%,熔点64-65 ℃,[α]D25=-24.8°(c1,CH3CH2OH),1H-NMR(500 MHz,CDCl3):δ 1.21(m,6H),2.84(d,1H),3.00(d,1H),4.32(s,1H),5.02(d,1H),5.12(s,4H),6.71-6.86(m,3H),7.25-7.44(m,10H)。HPLC分离条件:Daicel Chiral AD-H柱;正己烷 ∶异丙醇=85 ∶15;流速:1.0 ml/min;检测波长:237 nm,保留时间为45.2 min(见图3),ee>99.9%。

图3 (2S)-3-(3,4-二苄氧基苯基)-2-羟基丙酸异丙酯的高效液相色谱图Figure 3 HPLC of isopropyl (2S)-3-(3,4-dibenzyloxyphenyl)-2-hydroxypropanoate

2.7 (2R)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸异丙酯的合成

将(2R)-3-(3,4-二苄氧基苯基)-2-羟基丙酸异丙酯(0.84 g,2.0 mmol)、烘干无水的10%钯炭0.2 g,溶于15 ml乙酸乙酯,常温常压下加氢气过夜,砂芯漏斗过滤除去钯炭,滤液旋蒸,得(2R)-丹参素异丙酯为无色油状物0.45 g,产率93%,[α]D25=-9.85°(c1,MeOH),1H-NMR(500 MHz,CDCl3):δ 6.72-6.69(m,2H),6.52-6.50(d,J=7.65 Hz,1H),5.32(s,3H),5.03-4.98(m,1H),4.31(s,1H),2.95-2.91(dd,J1=3.45 Hz,J2=3.30 Hz,1H),2.76-2.71(dd,J1=6.95 Hz,J2=6.95 Hz,1H),1.23-1.22(d,J=6.25 Hz,6H);HRMS:C12H16O5[M+H+]241.103 1.HPLC分离条件:Daicel Chiral AD-H柱;正己烷 ∶异丙醇=85 ∶15;流速:1.0 ml/min;检测波长:237 nm,保留时间为24.2 min(见图4),ee>99.9%。

图4 (2R)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸异丙酯的高效液相色谱图Figure 4 HPLC of isopropyl (2R)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoate

2.8 (2S)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸异丙酯的合成

取(2S)-3-(3,4-二苄氧基苯基)-2-羟基丙酸异丙酯(0.84 g,2.0 mmol)、烘干无水的10%钯炭0.2 g,溶于15 ml乙酸乙酯,其余操作同1.2.7,制备得到(2S)-丹参素异丙酯为无色油状物0.43 g,产率90%,[α]D25=+9.73°(c1,MeOH),1H-NMR(500 MHz,CDCl3):δ 6.72-6.69(m,2H),6.52-6.50(d,J=7.65 Hz,1H),5.32(s,3H),5.03-4.98(m,1H),4.31(s,1H),2.95-2.91(dd,J1=3.45 Hz,J2=3.30 Hz,1H),2.76-2.71(dd,J1=6.95 Hz,J2=6.95 Hz,1H),1.23-1.22(d,J=6.25 Hz,6H);HRMS:C12H16O5[M+H+]241.1031.HPLC分离条件:Daicel Chiral AD-H柱;流动相为正己烷 ∶异丙醇=85 ∶15;流速:1.0 ml/min;检测波长:237 nm,保留时间为27.1 min(见图5),ee>99.9%。

图5 (2S)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸异丙酯的高效液相色谱图Figure 5 HPLC of isopropyl (2S)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoate

2.9 合成优化

如何保持前期手性化合物的光学纯度,该实验路线中的关键一步是脱去β位的羟基并完美保留α位的手性结构。为了优化改进前期合成路线中的不足之处,通过查阅文献[9,10],本研究选定CF3COOH为强酸脱羟基,Et3SiH为供氢试剂,考察了原料与它们之间的摩尔比对产物的产率、光学纯度的影响(见表1)。产物的产率、光学纯度主要由原料与CF3COOH之间的摩尔比有关。三氟乙酸的量减少,产物化学产率减少;三氟乙酸的量增加,产物发生外消旋化,光学纯度降低。最终选择原料与Et3SiH、CF3COOH之间的摩尔比为1 ∶3 ∶10时,所得手性丹参素异丙酯的化学产率、光学纯度均达到最佳。

表1 原料与Et3SiH、CF3COOH之间的摩尔比对产物的产率、光学纯度的影响Table 1 The effect of different mole of materials, Et3SiH and CF3COOH on yield and ee

3 讨论

丹参素异丙酯药效学研究表明,该物质能够增强心肌收缩力,保护心肌细胞超微结构,明显改善缺血缺氧大鼠脑部供血状况,降低脑梗死面积,减少水肿,具有较好的抗心脑缺血和抗心肌纤维化等作用[4]。而丹参素异丙酯是含有一个手性碳原子的手性药物,1992年,美国食品和药物管理局(FDA)发布了手性药物开发指导原则,对于手性药物不同对映体的药理作用、毒性和临床实验结果需要单独研究和申报。而2006年1月中国食品与药品监督管理局也出台了手性药物的有关药学技术指导。目前,高光学纯度的丹参素异丙酯用于化学1类新药临床前研究开发,建立高效、稳定的不对称合成路线是关键点。本课题组前期的研究建立了一条不对称合成丹参素异丙酯的路线[7],但是,该路线中手性邻二醇选择性脱氧过程,饱和的盐酸醇溶液pH难以控制,产物易外消旋化,不利于大规模生产。

本文路线设计中通过经典的Sharpless反应构建手性中心,得到双手性中心的丹参素异丙酯,且利用本实验室特有的两种手性催化剂(QN)2PHAL及(QD)2PHAL获得了两种互为对映异构体的双羟化产物,手性产物的光学纯度大于99.9%。在最为关键的Et3SiH、CF3COOH选择性脱氧步骤中,平行3次试验,产物的光学纯度均接近100%,表明本文优化改进的不对称合成新方法稳定性好。优化改进的丹参素异丙酯不对称合成新方法具有原料易得、操作简便、反应条件温、重现性好、不易消旋化和可控等优点。最后一步常温常压条件下氢化脱除保护基团对实验设备要求低,操作简便,安全可靠,有利于获得产率较好,空间构型保持不变的高光学活性的产物。此外,本文优化改进的不对称合成方法获得的产物质量均在毫克到克量级,为达到百克量级的中试放大条件,后期对于中试放大路线的研究仍然需要继续进行,为丹参素异丙酯大规模合成及实际应用提供一定的基础。