周群刚， 樊星砚， 代舒淇， 谢 莲， 陈韶华， 徐 军， 谢洪平*

(1.苏州大学医学部药学院，江苏苏州 215123;2.苏州市中心血站，江苏苏州 215006)

为了防止输血感染病毒,临床用血浆广泛采用亚甲蓝光照法对血浆病毒进行灭活，这是我国唯一获准在临床使用的单人份血液成分病毒灭活技术。其中，灭活袋中灭活剂亚甲蓝的释放量，是决定病毒灭活程度的关键参量[1]。亚甲蓝释放量过高，血浆中残留过大，易于导致累积毒性[2]；而过低，又不能保证病毒灭活[1]。大量数据表明，亚甲蓝必须保证在一个很窄的含量范围，而我国规定为0.9～1.3 μmol/L[3]。为了尽可能方便灵敏地检测释放量，已经报道了大量的、基于取样检测的方法，包括固相萃取-分光光度法[3 - 4]、增敏荧光光谱法[5]、高效液相色谱法[6 - 7]、化学发光法[8]、共振瑞利散射光谱法[9]。但是，这些有损检测方法，在取样时极易导致血浆二次污染。基于此，常常经释放量检测的血浆即不再用于临床。因此，对于每一袋进入临床的血浆，不可能均进行这样的基于有损检测的灭活质量控制。事实上，它的质量可靠与否仅仅是一个统计结果。对灭活袋中亚甲蓝释放量的无损检测，即是实现每一袋血浆灭活质量控制的关键问题。

在本实验室自行设计制造的透射平台上，利用近红外的高穿透性，结合近红外光谱和多变量分析方法，实现了“非取样方式”下的、在血浆灭活袋外对亚甲蓝释放量的快速无损透射检测。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

NEXUS近红外光谱仪(美国，Thermo公司)。由苏州市红十字中心血站提供非灭活的、病毒阴性的多人份血浆，使用一次性病毒灭活配套装置中的过滤器滤除白细胞，得不含亚甲蓝的血浆(即空白血浆)。一次性使用血液采输器(转移袋，规格：35 mL,生产批号：170428，四川南格尔生物科技有限公司)。亚甲蓝盐酸盐(分析纯，基于干燥品的含量>97%，Sigma-Aldrich公司)。实验用水为三次蒸馏水。

1.2 溶液配制

亚甲蓝储备液：称取亚甲蓝1.3953 g(分析纯，干燥失重率为10.6%)，置于500 mL的容量瓶中，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)定容。精密吸取1.00 mL亚甲蓝溶液，再用PBS定容至1 000 mL，即得7.8 μmol/L亚甲蓝储备液。避光、密封保存。待测样本：首先，利用亚甲蓝储备液和PBS(pH=7.4)，采用逐步稀释法配制一级和二级稀释液。之后，以储备液、稀释液和血浆，精密配制浓度为0.312～2.959 μmol/L的亚甲蓝血浆溶液共52个。最后，用一次性灭菌注射器向各血液采输转移袋中加注亚甲蓝血浆溶液，即得待测样本。

1.3 样本的近红外光谱检测

首先，用酒精擦拭待测血液采输转移袋外表面和透射石英玻璃窗。之后，将血液采输转移袋固定在透射平台(按中国专利201721367787.0自行设计制造)上，每次尽量将血浆袋的中间位置放置在夹套的检测窗片处，以防止其中的空袋部分出现在光路中，以保证样本的透射光谱测定。仪器参数为：波数4 000～10 000 cm-1，光程3.5 mm，分辨率8 cm-1，扫描次数32，扫描速度0.3165，光圈22，增益1。在当天检测样本前，用充有空气的、未使用的血液采输转移袋作为光谱背景。

1.4 建立亚甲蓝释放量的多变量分析模型

首先，将检测获得的血浆袋中样本的近红外透射光谱以3 999.7～4 265.8 cm-1区间的光谱为标准进行基线漂移校准。选择5 827.9～6 464.3 cm-1和7 467.1～9 009.9 cm-1为富信息区间，以均值中心化的光谱为模型变量，选择主成分数为11，按浓度的高低分布随机选择11个样本为预测集，以剩余的41个样本为校正集。由于偏最小二乘法(PLS)为最为稳健的多元分析方法之一，因此，选择以PLS方法建立亚甲蓝释放量的多变量分析模型。

2 结果与讨论

图1 血浆袋中样本的消除基线漂移的近红外(NIR)透射光谱(内插图：低波数区间的光谱，左图为原始光谱，右图为消除漂移的光谱)Fig.1 NIR spectra of samples in plasma bags after eliminating their baseline shifts(Insert:spectra in the range of low wavenumber, here the left for original ones and the right for shift-eliminated ones)

2.1 消除光谱基线漂移

对于近红外光谱的低波数区域，通常将会出现一段光谱基线。它应该是水平线，不同浓度的样本在该区间的光谱应该完全重叠、没有统计差异，且吸收度均值为0。从我们的检测结果(图1)可见，在3 999.7～4 265.8 cm-1区间即为各样本的光谱基线。然而，从原始光谱的放大图(图1内左插图)可以明显发现，不同浓度样本的基线发生了漂移，漂移量约为4～11，这种与浓度无关的漂移量将对亚甲蓝释放量的准确度产生影响。对每个样本的检测光谱在3 999.7～4 265.8 cm-1区间的所有吸光度求均值，即得漂移量，再将该检测光谱在各波长处的吸光度均减去该均值，即实现了检测光谱的基线漂移消除，从而获得该样本消除漂移后的光谱(图1)。从消除漂移后的放大图(图1内右插图)可以发现，光谱漂移已经被有效消除。

2.2 富信息光谱与主成分数

从基线漂移消除后光谱(图1)可以发现，亚甲蓝血浆样本在整个光谱区间出现了5 350～6 600 cm-1和7 200～10 001 cm-1两个区间的明显吸收峰，为吸收峰光谱区。对于前者，是由高低两个肩峰组成，在5 350～5 828 cm-1的低波数区域，光谱不但吸收度较低，基本为无峰的水平线，且出现了波浪式的毛刺，这类低信噪比的光谱信号将影响定量分析模型的精密度。而高波数区间6 464～6 600 cm-1的光谱，为该吸收峰的末端光谱，吸收度较低，信号较弱，同样也表现为低信噪比。因此，选择该吸收峰光谱区5 827.9～6 464.3 cm-1的光谱为富信号光谱。同理，在7 200～10 001 cm-1吸收峰光谱区，选择7 467.1～9 009.9 cm-1的光谱为富信号光谱。

以5 827.9～6 464.3 cm-1和7 467.1～9 009.9 cm-1的光谱为富信息光谱，以均值中心化的光谱为模型变量，以校正集样本按leave-one-out的交互检验，计算不同主成分数时PLS模型预测亚甲蓝浓度的残差(图2)。我们可以发现，随着主成分数的增加，预测的浓度残差具有逐渐减小的趋势，表明模型的准确性逐渐增高。当主成分数≥11以后，预测残差减小的程度明显变小，说明主成分数继续增加对模型准确性的贡献率较低。当然，主成分数过大也会导致模型的过拟合，因此，选择11为主成分数。

2.3 释放量的多变量分析模型与非损伤检测的准确度

以选择的两个区间的富信息光谱为亚甲蓝释放量的识别变量，基于前述确定的主成分数，经光谱均值中心化，利用PLS方法建立释放量的多变量分析模型，其中按亚甲蓝浓度的高低分布，随机选择11个样本为预测集，其余的41个为校正集，结果参见图3。可以发现，在多变量分析模型中，校正样本的校正浓度与真实浓度能够较好地相互对应，在整个检测浓度区间，它们均分布在真实浓度(对角线)附近，其相关系数Rcorr=98.16%。利用建立的模型，对独立的预测集样本中的亚甲蓝释放量进行预测(即测定)，也不难发现，这些样本的预测浓度仍然表现出了良好的对应关系，它们也能够分布在真实浓度的附近，其相关系数Rpred高达98.93%。由此表明，建立的模型应该具有良好的准确度。

图2 基于leave-one-out的交互检验的PLS模型的残差Fig.2 Residual of PLS model of cross-validation based on leave-one-out approach

图3 释放量的多变量分析模型Fig.3 Multivariate analysis model of the release amount of methylene blue:calibration sample;·:prediction sample.

为了进一步说明模型的准确度，我们设计了高中低浓度组的样本，进行了回收率试验，结果见表1。从表1可见，无论浓度高低，各浓度组均有良好的回收率，回收率在103.6%～110.8%之间，且没有浓度高低相关性，具有随机性，说明建立的无损检测方法准确、可靠。当然，最低回收率低至96%，而最高则高达119%，这对于一个无损的、快速检测方法，特别是生物样本的检测，这完全是一个可以接受的准确度。事实上，为了避免血浆的基质干扰可能会因不同人而存在微小差异，我们采用了10人份的血浆作为空白。在这种多人份血浆基质干扰的情况下，分析模型仍然保证了良好的准确性。当然，由于本文的样本量还较少，只能说明检测平台和检测方法的可行性，为实际的质量控制提供了科学性依据。若实际应用，还需要大量的样本和大量人份的空白血浆，以保证模型的稳健性。

表1 近红外光谱非损伤检测血浆中亚甲蓝释放量的准确度

3 结论

利用近红外光的良好穿透性，在本实验室自行设计制造的透射平台上，采用近红外透射光谱建立了血液采输转移袋中血浆病毒灭活剂亚甲蓝释放量的无损检测方法。将在血浆袋外进行无损检测获得的血浆袋中样本的近红外透射光谱作为识别变量，以PLS方法建立了亚甲蓝释放量的多变量分析模型。模型计算浓度对各样本浓度的相关系数分别为98.16%(校正集)和98.93%(预测集)，高中低浓度组样本的平均回收率在103.6%～110.8%之间。在本实验室自行设计制造的透射平台上建立的近红外透射光谱法能够实现在血浆袋外无损、快速、准确检测采输转移袋中亚甲蓝的释放量。预示着能够在无二次污染的条件下，实现对采输转移袋中血浆病毒灭活质量的监控。