费佳钰， Nguyen Thi Quynh Chau， 叶 泰， 袁 敏*， 徐 斐

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093)

1 前言

食品卫生安全问题是至关重要的民生问题，越来越受到世人的关注。如今，工业化进程日益加快，由此造成的一系列的重金属污染日趋严重[1]。重金属是指相对密度大于5的金属，如Cu、Pb、Zn、Fe、Co、Ni、Mn、Cd、Hg、W、Mo、Au和Ag等。尽管Mn、Cu、Zn等重金属是生命活动所必需的微量元素，但是大部分重金属如Hg、Pb、Cd等并非生命活动所必需，而且所有重金属超过一定浓度都会危害人体健康。重金属能形成复合物的形式，特别是当它与含N、S和O的配位体生物物质共存时，蛋白质分子结构因氢键断裂发生变化，重金属对酶产生抑制作用，导致酶失活，从而引起了各种不良影响[2]。事实表明，重金属污染的危害很大，因此寻求一种简便、高效、灵敏度高和选择性好的重金属检测方法显得尤为重要。

目前，根据不同的原理已经有一系列检测重金属的方法被相关研究人员广泛使用，比如原子吸收分光光度法[3 - 4]、原子荧光光谱法[5 - 6]、电感耦合等离子体光谱分析法[7 - 8]和X-射线光谱法[9 - 10]等。虽然这些传统的检测方法具有高灵敏度和重现性好的优点[11]，但是样品前处理通常比较复杂，往往需要浓缩、萃取和抑制其他离子干扰，仪器设备体积大且昂贵，需要专业的人员来操作，操作时间也较长，有些重金属离子在检测中会受其它金属离子的干扰而无法测定[12]。与传统的检测方法相比，电化学分析法有响应速度快和灵敏度高等优点，在重金属的存在下，电流、电化学阻抗和电容能发生改变,这些参数变化均可实现对重金属的检测[13 - 14]。然而电化学检测的特异性较为受限，因此电化学电极通常需要与功能材料联用，以提高电化学性能和检测的特异性[15]。功能材料包含无机材料、有机材料和生物材料等。其中，适配体是一种对靶标分子有特异性结合能力的功能核酸。它通常是一段经过体外筛选技术，即指数富集配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)得到的寡核苷酸单链DNA或RNA片段。核酸适配体和靶标分子在合适的环境下，通过静电、氢键、疏水堆积或范德华力等作用产生高度的亲和力，结合链内某些互补碱基的配对作用，令核酸适配体发生适应性折叠形成稳定的二级结构[16]，如发卡(hairpin)[17]、凸环(stem loop)[18]、G-四联体(G-quarter)[19]和T-交叉体(T-junction) 结构[20]等。因此，适配体对靶分子具有高度特异的识别能力。此外，核酸适配体的人工合成工艺成熟、制备快速、经济成本低、通用性强[21]，能与生物小分子、蛋白质、多肽、有机物及金属离子等多种靶标分子进行特异性的结合[22 - 25]。在检测重金属方面，适配体-电化学联用技术比单纯的电化学技术展现了更好的特异性和更高的灵敏度，因而被广大相关研究人员关注。根据是否应用标记物产生信号，适配体-电化学生物传感器可分为标记型和非标记型。标记型适配体-电化学生物传感器又被分为三种：氧化还原电活性分子标记型、酶标记型和纳米材料标记型[26]。

2 非标记型适配体-电化学生物传感器

当没有标记物存在时，传感器获得的电化学检测信号往往是基于适配体探针与目标物结合前后所导致的传质或电子传递位阻变化[26]。根据Pb2+与DNA特异性结合形成的超强G-四联体结构的稳定性,Gao[27]等使用硫堇作为信号分子，以石墨烯作为信号增强的平台，构建非标记适配体-电化学生物传感器。该传感器首先基于石墨烯的六角形与碱基的平面结构之间的π-π堆积相互作用，将石墨烯组装到电极上，然后通过更强的π-π作用进一步将硫堇吸附到石墨烯表面，形成了Pb2+识别层。当Pb2+存在的时候，电极表面的ssDNA结构转变为可折叠的G-四联体结构，石墨烯的亲和力下降，石墨烯-琉堇复合物从感测接口释放，导致传感器的氧化还原信号减少。在最佳实验条件下，峰值电流的衰减与Pb2+浓度(1.6×10-13到1.6×10-10mol/L)的对数呈现良好的线性关系，检出限约为3.2×10-14mol/L。这种传感器表现出良好的再生性和可接受的再现性，说明它能被良好地运用在重金属检测上。崔琳等[28]通过Au-S键将适配体自组装在丝网印刷碳电极上构建了非标记型适配体-电化学传感器。这里的适配体是Ars-3，它可以通过静电相互作用吸附阳离子聚二烯丙基二甲基胺(PDDA)以排斥其他阳离子。通过圆二色谱测量，表明As(Ⅲ)可以结合Ars-3上一些碱基并改变其构象，抑制了具有脱氧核糖碱基间强的π-π*转换，导致PDDA的吸附减少，因此可以吸附更多带正电荷的电化学活性指示剂，检测的敏感度增强。在最佳条件下，检出限低至1.5×10-10mol/L。此传感器结合了一次性丝网印刷电极，具有成本效益。

3 标记型适配体-电化学生物传感器

随着如今分子标记技术的日益成熟，标记型适配体-电化学传感器被运用的也越来越广，适配体或靶分子被标记修饰后，传感器的检测更灵敏。

3.1 氧化还原电活性分子标记型

适配体本身电化学信号比较微弱，可以通过物理吸附、化学吸附、共价键合、生物亲和等各种手段将各种具有电化学氧化还原活性或催化活性的信号分子修饰到靶分子上，从而增强电化学信号，这类电活性物质，如二茂铁(Fc)和亚甲基蓝(MB)等，在检测过程中以目标分子结合适配体导致的电化学信号衰减程度作为定量的标准。Zhuang等[29]报道了基于Hg2+诱导的DNA发夹结构，其中在每个发夹环的中间用Fc氧化还原标记物标记。当Hg2+存在时，Hg2+介导的碱基从粘性末端到打开发夹，发生的构象变化导致Fc靠近电极以增加氧化还原电流。T-Hg2+-T的强配位反应具有良好的重复性，检测到的Hg2+动态浓度范围为5.0×10-9mol/L至1.0×10-6mol/L，检测限为2.5×10-9mol/L。Wu等[30]将Fc修饰在DNA末端，设计一条与其互补的DNA链，通过Au-S键固定在Au电极上，当Hg2+不存在时，两条DNA链互补，Fc靠近Au电极，得到强的电化学信号，当Hg2+存在时，Hg2+与DNA特异性结合，导致两条链分离，Fc远离Au电极，电化学信号减弱，完成了对Hg2+的检测。该电化学生物传感器检测限6.0×10-11mol/L。Wen等[31]利用MB作电化学信号标记，通过ssDNA诱导的构象变化检测亚砷酸盐，检测限为1.0×10-9mol/L。利用相同原理检测重金属离子的研究还有很多,设计的这些传感器都有很好的选择性和灵敏度，所用的适配体长度也在不断缩短，找到最容易结合的位置，目的是进一步提高灵敏度。

3.2 纳米材料标记型

纳米材料，是指其结构单元的尺寸介于1～100 nm范围之间的一种新型的特殊材料。纳米颗粒材料自20世纪70年代问世以来，凭借其独特的表面效应、导热性质和光学性质等受到人们的广泛关注，被运用到各个领域，掀起了研究热潮[32]。

3.2.1纳米粒子标记型纳米粒子具有易于合成、粒径小、占比面积大以及表面自由能高[33]等特性，提高了重金属检测的灵敏度。根据纳米材料种类，纳米粒子标记型又可以分为金纳米粒子(AuNPs)标记型和量子点(QDs)标记型。AuNPs具有生物相容性、高电子密度、介电特性、催化作用、荧光猝灭效应、光热转换、表面增强拉曼散射效应和表面等离激元共振效应(SPR) 等特性[34]，这些优势使其被广泛运用在疾病诊断、生物及食品安全检测等方面[35 - 37]。Wang等[38]开发了一种基于胸腺嘧啶(T)修饰的金纳米颗粒/还原氧化石墨烯(AuNPs/rGO)纳米复合材料可重复利用的电化学传感器，用于检测Hg2+。当Hg2+存在时，T碱基和Hg2+的特异性结合形成T-Hg2+-T配合物相互作用，AuNPs/rGO纳米复合材料将电化学信号放大，检出范围为5.0×10-11～5.0×10-6mol/L，检测限低至7.0×10-12mol/L。运用同样的T-Hg2+-T 的特异性结合，Wang等[39]开发了基于T-Hg2+-T复合物和三螺旋DNA的电化学传感器检测Hg2+,AuNPs与游离的ssDNA结合,同时AuNPs上的其他游离的ssDNA可以在Ag+的存在下结合，形成稳定的胞嘧啶-Gly-胞嘧啶(C-Ag+-C)复合物和环扩增，大量的C-Ag+-C可以通过电化学还原形成银纳米团簇，获得Ag+溶出伏安信号，AuNPs可以加速银剥离，从而使电信号放大来测得Hg2+浓度，该传感器可以在1.0×10-10至1.3×10-7mol/L范围内检测，检出限为3.0×10-11mol/L。Chen等[40]将AuNPs固定在Au电极上放大电化学信号，和不固定AuNPs对比[41]，发现对Cu2+检测限明显降低。

量子点(QDs)是指元素周期表Ⅱ-Ⅳ或Ⅲ-Ⅴ族的半导体纳米材料[42]，主要为复合结构或多层核壳结构，具有一些独特的光学和电学性质，如窄尺寸分布、高量子化、尺寸依赖性吸收和光致发光等[43]。QDs标记型传感器通过适当的方法将QDs标记到适配体或靶分子上，利用测量传感器上结合的QDs组分中重金属的含量，从而测出靶分子中重金属的含量，这种传感器可以实现多组分的同步测定。例如，Lu等[44]报道了一种基于CdSe QDs标记ssDNA的电化学发光传感器。实验中先通过经典的Au-S键将DNA组装到电极上，再通过酰胺键将末端氨基标记的DNA连接到羧化的CdSe QDs。当Pb2+存在时，富含G碱基的单链会折叠成G-四联体结构，使得CdSe QDs与Au电极之间的距离缩短，从而降低电化学发光强度。在一定范围内，Pb2+浓度与电化学发光强度呈现正相关，因此可以利用这种传感器检测Pb2+的含量。该传感器的检测范围为1.0×10-10～1.0×10-8mol/L,检出限为1.0×10-10mol/L。Hu等[45]报道了一种同时使用AuNPs和CdTe QDs标记的适配体-电化学传感器，用于检测Hg2+。当Hg2+不存在时，适配体吸附在AuNPs表面，防止盐诱导的AuNPs发生聚集，导致CA-CdTe QDs的荧光猝灭；当Hg2+存在时，适配体与Hg2+高度特异性结合形成T-Hg2+-T结构，AuNPs形成蓝色聚集体，蓝色聚集体不能猝灭CA-CdTe QDs的荧光，猝灭的荧光被恢复，荧光猝灭的程度随有效猝灭剂数量的减少而减少，CA-CdTe QDs的荧光强度随Hg2+量的增加而恢复，荧光强度与Hg2+的浓度成线性比例关系。这种传感器的检测范围在5.0×10-11至1.0×10-9mol/L内，检出限为2.5×10-12mol/L。

3.2.2石墨烯石墨烯(Graphene)是一种由碳原子构成的单层片状结构的新材料，是以sp2杂化轨道组成六角型呈蜂巢晶格的平面薄膜[46]。石墨烯和核碱基之间能产生疏水和π-π堆叠相互作用，氧化石墨烯纳米片可以有效地结合单链DNA[47]，可以防止单链DNA从石墨烯表面解离出来[48]，Hg2+可以特异性地结合DNA的两个胸腺嘧啶(T)残基以形成T-Hg2+-T复合物。根据这个原理，Lu等[49]通过氧化石墨烯纳米片指示剂标记的聚-T(15)寡核苷酸诱导目标解离，在T-Hg2+-T配位结构的基础上对Hg2+进行测定，检出限为1.2×10-10mol/L。这种方法实验的重现性比较好，能有效地筛选出水样中的Hg2+。

3.3 DNA酶标记型

酶具有高效的催化效应，各种各样的蛋白酶、DNA酶和RNA酶被广泛应用于标记不同的生物传感器。在重金属检测中，运用得较多的是DNA酶。DNA酶的稳定性更高，经过多次变性、复性之后活性也不受影响，具有较强的识别能力。但是单个DNA酶的催化活性并不高，只有当它与核酸、氨基酸或金属离子等辅助因子结合时，才能发挥出高效的活性，进而可以被用于检测重金属离子。根据GR-5酶对Pb2+具有较好的选择性这一特点,Gao等[50]基于GR-5前导-依赖性DNA酶建立了检测Pb2+的电化学传感器，当Pb2+存在时，底物在易裂解的核糖腺苷切割成两个片段，发生DNAzyme的解离，导致插入的Ru[(phen)3]2+的释放，同时伴随着电化学发光强度的降低，可以从发光强度的减少来计算Pb2+的量,检出限为9.0×10-13mol/L。除此之外，还有很多研究学者也利用了DNA酶与重金属结合的原理实现重金属离子的检测[51 - 53]，这种传感器是一种新兴的检测技术，具有较大的发展潜力。

4 结论与展望