夏 舒， 陈 钰， 李 昕， 张海燕， 刘仲明， 王 捷*

(1.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006;2.广州军区广州总医院医学实验科， 广东广州 510010)

传统的核酸检测技术主要有聚合酶链式反应(PCR)、原位荧光杂交技术(FISH)[1]、DNA测序技术[2]等。PCR是目前运用最广泛的核酸分子检测技术，但依赖精密的控温设备及专人操作，使其只能在条件完备且专业化程度高的实验室应用。核酸等温扩增技术是20世纪90年代提出的新型核酸扩增技术，相比于PCR，其可以在恒定的温度下对核酸进行扩增，大大降低了对仪器的要求[3]。2006年，英国TwistDx Inc公司开发了一种重组酶聚合酶扩增(RPA)技术，RPA反应可在25～42 ℃恒温条件下快速完成核酸扩增[4]，反应条件宽松。目前RPA结合凝胶电泳[5]、侧流层析[6]和荧光探针法[7]等不同的结果判读方法，已开发出多种较为成熟的检测试剂盒[4]，但是判读方法难以做到快速且高灵敏地检测。电化学发光法(ECL)[8]检测具有灵敏度高、检测线性范围宽、抗干扰能力强和检测时间短等特点[9]。邢达和周小明等将PCR与ECL结合进行转基因[10]和基因突变[11]检测，方法具有较高的检测灵敏度。但是传统的电化学检测池由于样品残留问题，容易造成交叉污染[12]。采用一次性纸芯片[13]电极可避免该问题的产生，而且纸芯片电极具有检测用量少、成本低、操作方便等特点[14]。吴鲁丹[15]等将滚环扩增(RCA)与纸基ECL检测结合，对IgG的检测限达到0.15 fmol/L，但是RCA时间相对较长(>60 min),而且只适用于环形DNA或环状核酸，因此在实际运用中受到极大的限制。

本研究以含乙型肝炎病毒(HBV)基因片段的质粒为模板，设计特异性引物，上游引物标记三联吡啶钌，生物素标记下游引物，重组聚合酶扩增反应形成双标记扩增子，磁分离纯化后进行纸基ECL检测。将RPA技术与纸基ECL结合，构建一种灵敏特异、操作简便、快速低成本的分子检测技术，可为核酸的快速检测提供实验依据。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

聚合酶链式反应(PCR)仪(MJ Mini S/N:MMO10907,美国BIO-RAD公司)；纸芯片电化学发光测试仪[16](XQT-152,广州军区广州总医院与西安新启特仪器仪表有限公司联合研制)；Nanodrop 2000分光光度计与Multiskan GO全波长酶标仪(芬兰Thermo Fisher Scientific公司)；恒温金属浴(美国CORNING公司)；SIGMA1K5离心机(美国Sigma-Aldrich公司)；8孔磁分离架与Amicon Ultra-0.5(0.5 mL 3 KD)超滤管(德国Millipore公司)；Zensor三电极纸芯片(No.TE100-OA，禅谱科技股份有限公司)；Whatman 1号色谱纸(英国Whatman公司)。

含乙型肝炎病毒(HBV)基因片段质粒(浓度：120 ng/μL)和对应的特异性引物由中国人民解放军302医院提供和设计；氨基修饰引物和生物素标记引物(NH2-AGCATCCAGGGAATTAGTAGTCAGCTATG,Biotin-GACCTGCCTCGTCGTCTAACAACAC,分子量分别为9145.1和7951.9,苏州泓讯生物科技公司)；TwistAmpTM-Basic RPA试剂盒(英国TwistDx-Inc公司)。链霉亲和素磁微球(浓度：0.72 mg/mL,瑞士Roche公司)，三丙胺(TPA,美国Sigma-Aldrich公司)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF,99.5%,分析纯,美国Sigma-Aldrich公司)，酯化钌(Bis(2,2′-Bipyridine)-4′-methyl-4-carboxybipyridine-ruthenium N-succinimidyl ester-bis (hexafluorophosphate),λAbsorption=455 nm,ε=13 700 L/(mol·cm),Ru-NHS ester,美国Sigma-Aldrich公司)，H3BO3和NaOH(广州化学试剂厂)。

1.2 实验方法

1.2.1三联吡啶钌标记引物标记参考文献方法[17]并有所改进。取1 mg酯化钌溶于98.5 μL DMF中，振荡混匀，配成10 mmol/L溶液于4 ℃保存待用。将2.9 nmol氨基修饰引物8 000×g、4 ℃离心5 min，加入58 μL 0.1 mol/L H3BO3(pH=8.5)，振荡混匀后5 000×g、4 ℃离心3 min，配成50 μmol/L氨基修饰引物溶液。取5 μL浓度10 mmol/L酯化钌溶液和50 μL浓度50 μmol/L氨基修饰引物溶液混合均匀(摩尔比20∶1)，室温避光混匀，30 r/min反应12 h。反应完成后加入去离子水(ddH2O)至500 μL,超滤管14 000×g离心分离30 min洗脱游离酯化钌,1 000×g反向离心2 min回收三联吡啶钌标引物，重复以上操作3次。分别对氨基修饰引物、酯化钌和三联吡啶钌标记引物进行波段(200～1 000 nm)扫描，确定最佳吸收波长，利用分光光度法分别对三联吡啶钌标记引物和氨基修饰引物溶液进行测定，并计算标记率。

1.2.2重组聚合酶扩增反应参数优化RPA反应体系(50 μL)包括：2.4 μL三联吡啶钌标引物、2.4 μL生物素标记引物、29.5 μL缓冲溶液、13.2 μL HBV质粒模板、干粉试剂(TwistAmp© Basic试剂)以及280 mmol/L Mg(Ac)2。设计扩增时间、温度、引物浓度和Mg(Ac)2添加量四因素五水平的正交试验，具体见表1。分别进行ECL检测，分析确定最佳RPA扩增条件。

表1 正交试验因素和水平设计

1.2.3磁分离及纸基电化学发光核酸检测取2 μL RPA扩增产物、8 μL 0.72 mg/mL链霉亲和素磁珠和20 μL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7.4)混合均匀，置于37 ℃下孵育30 min，12 000×g离心2 min，磁力架固定磁珠并吸取上清液，加入PBS洗涤3次。将清洗后的磁珠均匀分散于5 μL浓度为40 mmol/L TPA中，并滴加至纸基电极上，在0.2～1.5 V范围内，以0.1 V/s的扫描速率进行循环伏安扫描，在PMT为1 000 V下检测电化学发光响应。

2 结果与讨论

2.1 三联吡啶钌标记引物及表征

图1 氨基修饰引物溶液、酯化钌溶液、三联吡啶钌标记引物溶液、ddH2O紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱图Fig.1 UV-Vis absorption spectra of amino modified primer solution,Ru-NHS ester solution,tripyridine ruthenium labeled primer solution and ddH2O

酯化钌和三联吡啶钌标引物溶液在455 nm波长处均出现明显的信号峰，而引物与ddH2O并未出现明显的信号峰(图1)。根据反应方程式(图2)及相关文献[17]，酯化钌与氨基修饰引物反应摩尔比为1∶1，因此可通过测定455 nm波长下三联吡啶钌标引物的摩尔量得到实际参加反应的氨基修饰引物的摩尔量。实验测得氨基修饰引物稀释10倍后，在波长为260 nm时的吸光度A260为2.612，三联吡啶钌标引物在波长455 nm时的吸光度A455为0.146，因此通过以下公式计算得到标记率为74.62%。

/(ε·d·F·A260·D·VNH2-Primer)×100%

图2 酯化钌与氨基修饰引物化学反应方程式Fig.2 Chemical equation of Ru-NHS ester reacts with amino modified primer

2.2 重组聚合酶扩增反应相关条件的优化

试验结果见表2。经正交试验设计及电化学发光检测分析得出，相关条件最佳组合为A3B1C4D4，即RPA最佳扩增时间为20 min，扩增温度为30 ℃，引物浓度为0.8 μmol/L(添加量为2.4 μL)，Mg(Ac)2的浓度为280 mmol/L(添加量2.5 μL)。通过极差分析可得，相关因素的影响程度为：扩增时间>扩增温度>引物浓度>Mg(Ac)2添加量。重组聚合酶扩增技术可以在短时间内对HBV基因质粒核酸进行扩增，且扩增可在恒定温度下进行，不受温度条件的限制，适合于条件有限的现场快速检测方面的运用。

表2 RPA相关影响因素的正交试验设计及纸基ECL检测分析

(续表2)

No.ABCDAmplification time(min)Amplification temperature(℃)Tripyridine ruthenium labeled primer concentration(μmol/L)Magnesium acetate volume(μL)Test result (Peak area,y)62(10 min)12341187223441028234534979245130521025123225113(20 min)135101911232416971133352399714341332091535244143164(25 min)14259401742535798184314410319442541582045313483215(30 min)15462982252153000235321209224543225552555432132y∗i14205.2579731953607.2y∗i23598.84389.83317.83559y∗i35702.235674895.43880.6y∗i44696.442315344.25365.4y∗i53215.43433.24665.65005.8Max5702.2(A3)5797(B1)5344.2(C4)5365.4(D4)Range2486.82363.82149.21806.4

*yij=(∑yij)/5)，i=1,2,3,4;j=1,2,3,4,5.

图3 不同浓度HBV基因质粒模板的ECL响应图(内插图为校正曲线)Fig.3 ECL response of different concentrations of HBV gene plasmid template(inset is calibration curve)from a to h:0,0.0012,0.012,0.12,1.2,12,120,1200 ng/mL respectively.

2.3 纸基电化学发光响应特性

2.3.1线性范围及检出限电化学发光响应特性见图3，随着HBV基因质粒样品浓度的增加，电化学发光响应强度也随之增大，且样品电化学发光响应强度在0.12～1 200 ng/mL浓度之间呈现良好的线性关系，检出限(S/N>3)为1.2 pg/mL。所构建的方法对HBV基因检测具有较高的灵敏度和较宽的线性范围。

2.3.2重复性通过相对标准偏差(RSDs)考察方法的重复性，选择0.12 ng/mL和120 ng/mL两个浓度的HBV基因质粒样品，每个浓度样品进行5次RPA-ECL重复性检测，得到电化学响应特性见图4。计算得出RSD分别为5.18%和6.40%，说明本方法的重复性良好。

图4 120 ng/mL(a)和0.12 ng/mL(b)HBV基因质粒模板ECL重复检测响应图Fig.4 ECL responses of repeated test on HBV gene plasmid template at 120 ng/mL (a) and 0.12 ng/mL (b)

3 结论

本研究将重组聚合酶扩增技术与纸基电化学发光检测相结合，利用了电化学发光灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强和RPA技术特异性高、操作简便的特点，通过外加磁场快速高效地分离出RPA扩增产物，利用一次性纸基电极，简化了操作步骤，避免了交叉污染，降低了检测成本。最终构建出一种高特异性、高灵敏度、操作简便、快速低成本的核酸检测方法，在条件有限的现场快速检测领域有非常好的应用前景。