吕鉴泉*, 罗诺琳， 谢水勇, 张恒铭

(嘉应学院化学与环境学院，广东梅州 514015)

广东省梅州市蕉岭县是国际自然医学会认定的世界第七个“世界长寿乡”(中国第四个“世界长寿乡”)，长寿现象激起了人们对蕉岭的人文、自然与生态环境、饮食习惯等方面的研究兴趣，特别是蕉岭的富硒环境对长寿的贡献。

硒是一种生命体必须的化学元素，既具营养与药理功能、又有毒理效应[1 - 2]。其功能与效应，一方面取决于硒存在的化学形态，不同形态的硒存在差别明显的毒理、药理效应[3]；另一方面，还与总硒以及不同硒形态的浓度水平直接相关，硒的匮乏往往诱发区域性疾病，而过量的硒可引起神经系统异常乃至死亡[4]。因此，在研究富硒环境对长寿的贡献时，硒的存在形态及其获取方法、毒(药)效应及其生物可利用度等方面信息至关重要。目前，就农产品中各种硒形态的提取、分离与检测技术而言，无机硒的技术较为成熟，而有机硒的技术则因其形态的多样性与复杂性尚待在传统方法的基础上进一步完善[5]。

本文以蕉岭境内生长周期短[6]、富硒能力强[7]的紫云英为研究对象，采用广泛使用的溶剂提取、微波消解、氢化物-原子荧光光谱法探讨硒的赋予形态及其变化，以期为总结蕉岭生态地理环境中硒的转化及其对长寿的贡献提供基础信息。

1 实验部分

1.1 药品与仪器

硒元素标准溶液(100 μg/mL，中国计量科学研究院)，透析袋(7 000 Da，上海源叶生物科技有限公司)。所用其它药品均为国产分析纯及以上规格的试剂，实验用水均为本实验室自制的超纯水。

AFS933原子荧光光度计(北京吉天仪器有限公司)；XH-200A电脑微波固液相合成/萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公司)；XH-2008D型电脑智能温控低温超声波合成萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公司)；TG20-WS高速离心机(郑州宏朗仪器设备有限公司)；XS-02多功能粉碎机(上海兆申科技有限公司)。

1.2 样品采集及处理

现蕾期、盛花期和成熟期自然生长的紫云英样品，分别于3月上旬、4月中旬和5月底采集自广东省梅州市蕉岭县三圳镇约2平方公里区域内，每期10个点的全草作为样品，并分别标记为A、B、C。各期的新鲜紫云英弃去杂草、枯叶、泥土和污垢，水洗净，烘干，粉碎，过100目筛，粉末分别装入试剂瓶中保存，备用。

1.3 测定方法

1.3.1硒的定量根据国家标准《食品中硒的测定》(GB 5009.93-2010)，采用氢化物发生-原子荧光光谱法(HG-AFS)，按照表1条件测定硒标准溶液的荧光强度，取3次测定的平均值绘制标准曲线。测定样品时，控制与标准曲线相同的条件，均由荧光强度换算成硒含量。实验结果表明，0.07～10.00 μg/L的硒与信号呈现良好的线性关系，响应方程：y=33.13x+1.03，相关系数(R2)为0.9998。该方法的检出限为0.0657 μg/L；重复11次测量10 μg/L的硒标准溶液，测量结果的相对标准偏差为1.05%。

表1 测量条件

1.3.2总硒含量的测定借鉴文献方法[8]微波消解样品。具体操作如下：准确称取0.5 g紫云英粉末于三颈烧瓶中，分别加入5 mL浓HNO3和1 mL 30% H2O2，在120 ℃、800 W功率下微波消解30 min，电炉上加热至溶液澄清透明，冷却至室温，加入HCl(1+4)，转移至100 mL的容量瓶中，定容。取适当体积的消解液用HG-AFS法测定总硒的含量。

1.3.3无机硒含量的测定按照文献方法[9]，准确称取紫云英干粉0.5 g，放入研砵中，滴加少许超纯水充分湿润紫云英粉末，在研砵中用力碾磨紫云英粉末以使细胞充分破裂，碾磨后的粉末转移至锥形瓶中，加入10 mL超纯水，沸水浴中提取30 min，冷却至室温，在550 W条件下超声10 min，溶液在4 000 r/min条件下离心10 min，上清液用HG-AFS法测定无机硒的含量。

1.3.4核酸硒含量的测定借鉴文献方法[10]，采用浓盐法提取-微波消解-HG-AFS法测定紫云英中核酸硒的含量。具体操作如下：准确称取紫云英干粉0.5 g，加入15 mL 12% NaCl溶液，于沸水浴中反应40 min后抽滤，用相同步骤对滤渣重提二次，合并滤液，用10 mL氯仿-正丁醇(4∶1，V/V)除去蛋白质后，溶液用6 mol/L HCl调节pH至2.5，4 ℃静置12 h，3 000 r/min离心30 min，得核酸沉淀，用95%乙醇多次冲洗沉淀，微波消解沉淀，HG-AFS法测定紫云英中核酸硒。

1.3.5多糖硒含量的测定参考文献方法[11]，在提取核酸的基础上，采用草酸法提取-微波消解-HG-AFS法测定紫云英中多糖硒的含量。具体操作如下：向提核酸后的滤渣中加入25 mL 3%的草酸溶液，沸水浴中提取30 min，抽滤，重提二次,合并滤液,用15 mL的氯仿-正丁醇(4∶1，V/V)除去蛋白质后,水相加入300 mL 95%乙醇，4 ℃下静置12 h,3 000 r/min离心30 min,得多糖沉淀,用85%乙醇多次冲洗沉淀，按上述微波消解沉淀、HG-AFS法测定多糖硒。

1.3.6蛋白硒含量的测定参考文献方法[12]，具体操作如下：准确称取0.5 g紫云英粉末至烧杯中，加入15 mL 0.1 mol/L KOH溶液，于50～60 ℃水浴中搅拌提取4 h，抽滤，用0.1 mol/L KOH溶液重复2次处理滤渣。合并滤液，加(NH4)2SO4至50%饱和度，4 ℃冰箱中静置过夜，4 000 r/min下离心15 min，收集沉淀。沉淀用5 mL Tris-HCl溶液(pH=8)溶解，转移至预处理好的透析袋中，纯水中透析直至透析液不与10% BaCl2产生白色沉淀。样品按HG-AFS法测定蛋白硒的含量。

参考文献方法[13]，具体操作如下：测定水溶性、盐溶性、醇溶性和碱溶性硒蛋白含量时，依次用相同体积的水、0.5 mol/L NaCl、75%乙醇溶液和0.1 mol/L KOH为浸提液(代替0.1 mol/L KOH溶液)，除水溶性硒蛋白需要水浴提取外其它硒蛋白均在不加热条件下提取，分别用少量浸提液溶解沉淀的蛋白质，其它操作与蛋白硒所述的相同，用微波消解-HG-AFS法测定对应的蛋白硒含量。

2 结果与讨论

2.1 总硒、无机硒与有机硒

按照实验方法测定紫云英中总硒和无机硒，有机硒含量为总硒与无机硒的差值，结果列于表2。从表中数据可以看出：(1)随着紫云英的生长成熟，其中的总硒含量也随之增加，从现蕾期到盛花期总硒含量增长了26.7%，从盛花期到成熟期总硒含量增长了50.8%；(2)现蕾期、盛花期和成熟期的紫云英，有机硒含量分别为89.0%、91.7%和93.7%，无机硒含量分别为11.0%、8.30%和6.36%，数据说明，紫云英中硒的主体是有机硒，并且随着紫云英的生长成熟无机硒的比重降低、有机硒的占比上升。此结果与周乾坤等人[14 - 16]人工施加亚硒酸钠于土壤或者叶面所培植的紫云英各项硒比例基本一致。

表2 紫云英中的总硒、有机硒与无机硒

*average ± standard deviation(n=5).

植物中的硒有无机形态的硒(简称无机硒)和有机形态的硒化物(简称有机硒)两种形态。无机硒主要以单质硒、金属硒化合物、硒酸盐或者亚硒酸盐等形式存在于植物之中，其典型特征是价态多样性，易溶解于水[9,17]。有机硒的特征是直接与碳成键的、并以-2价存在于蛋白质、脂肪、多糖和核酸等有机分子中[18]。

2.2 有机硒的赋予形态

按照实验方法测定核酸硒、多糖硒和蛋白硒的含量，结果汇总于表3。表3数据显示，现蕾期紫云英核酸硒、多糖硒和蛋白硒分别为5.70%、15.0%、71.0%，还有约8.30%的其它形态有机硒；盛花期紫云英核酸硒、多糖硒和蛋白硒分别为3.10%、15.5%、74.6%，其它形态有机硒约有6.83%；成熟期紫云英核酸硒、多糖硒和蛋白硒分别为2.24%、16.3%、76.2%，其它形态有机硒约有5.27%。这些数据说明：(1)随着紫云英的生长成熟，蛋白硒和多糖硒有一定程度的增加，而核酸硒和其它形态有机硒稍有降低的趋势；(2)按照含硒量由高到低排列，蛋白质硒>多糖硒>核酸硒；(3)86%～92%的有机硒主要存在于蛋白质和多糖之中，也就是说蛋白质和多糖是紫云英中硒的主要赋存形态。

表3 紫云英中的有机硒形态

*average ± standard deviation(n=5).

紫云英中有机硒的形态分布，与刺参[8]、蛹虫草[9]、蓝莓[13]、灵芝[19]、枸杞[20]等植物中有机硒的分布非常相似。其原因可能是，因硒与硫属于同一主族且性质相似，无机硒经吸收后，硒往往是沿着硫代谢的途径，产生的一些R-Se-R形式的氨基酸、含硒多肽、硒多糖和含硒RNA等有机分子[21]。

2.3 蛋白硒的赋予形态

图1 紫云英中水溶性、盐溶性、醇溶性和碱溶性硒蛋白Fig.1 Water-soluble,sodium chloride-soluble,ethanol-soluble and alkali-soluble selenium protein in Astragalus sinicus

为进一步探究紫云英中蛋白硒的存在方式，分别用水、NaCl、乙醇和KOH溶液为浸提液提取紫云英中的水溶性、盐溶性、醇溶性和碱溶性硒蛋白等四种蛋白[19]，结果见表4。表4数据显示，现蕾期紫云英中水溶性、盐溶性、醇溶性和碱溶性硒蛋白分别为47.91%、11.23%、9.43%和24.81%，还有约6.62%的其它形态硒蛋白；盛花期紫云英中水溶性、盐溶性、醇溶性和碱溶性硒蛋白分别为41.13%、9.91%、11.75%和29.07%，另有约8.14%的其它形态硒蛋白；成熟期四种硒蛋白分别为39.45%、7.24%、12.83%和31.23%，有9.25%的其它形态硒蛋白。各个生长时期的各种硒蛋白的变化规律于图1所示。这些数据显示：(1)随着紫云英的生长成熟，各种溶解性蛋白的含硒量均有增加，但醇溶性、碱溶性和其它形态硒蛋白的硒比重有一定程度的增加，而水溶性、盐溶性硒蛋白的硒占比稍有降低；(2)按紫云英中蛋白含硒量从多到少的排序，其为水溶性硒蛋白>碱溶性硒蛋白>醇溶性硒蛋白>盐溶性硒蛋白；(3)硒蛋白主要以水溶性和碱溶性硒蛋白形式存在，约占得硒蛋白含量的70%，说明紫云英中的蛋白是酸性或极性较强的蛋白[19]。

表4 紫云英中的蛋白硒形态

*average ± standard deviation(n=5).

一般而言，蛋白质依其溶解性可以分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、麦谷蛋白和残渣蛋白等五类[22]。清蛋白为水溶蛋白，分子量较低，溶于水；球蛋白俗称盐溶蛋白，易溶于稀盐水；醇溶蛋白是通过氢键和疏水键相互作用形成的单链蛋白，可用50%～90%乙醇提取；碱溶性蛋白，又称麦谷蛋白，是指通过分子间二硫键连接多个亚基而成的大分子物质，易溶于稀酸或稀碱(其溶解性随肽链上二硫键数目的增加而减小)，但不溶于水、盐及醇溶液。残渣蛋白是指具有纤维状结构，不溶于水，但可以酶解。由于生命体的胃液等为弱酸性，以水溶性和碱溶性硒蛋白为主体的硒蛋白，可以被生命体吸收。

3 结论

本文采用溶剂提取、微波消解、氢化物发生-原子荧光光度法等技术，研究了各个生长时期紫云英中硒的赋存形态。结果表明，随着紫云英的生长成熟，总硒含量和有机硒含量逐渐增加，无机硒含量逐渐降低。成熟期的紫云英中，总硒量为1382 μg/kg，有机硒达到总硒的93.7%；有机硒主要以蛋白硒和多糖硒形态存在，分别占总硒量的76.2%和16.3%；而蛋白硒主要表现为易于被生命体吸收的水溶性硒蛋白和碱溶性硒蛋白形态，分别占蛋白硒量的39.5%和31.2%。