孙鹥 ，范欣，徐亚，井敏敏

（云南省第一人民医院检验科，昆明650032）

白血病是小儿最为常见的恶性肿瘤，是我国十大高发恶性肿瘤之一，据统计，全球每年约有37万例新发病例，有27万人死于白血病[1]。但白血病的病因与发病机制目前尚不完全清楚，病毒感染、遗传、染色体异常及化学毒物或药物等因素都与白血病的发病有关。尽管目前利用基因表达谱和全基因组测序分析已经发现多个基因与白血病发生相关，但真正能用于白血病诊断及治疗的基因为数不多。所以，筛选与白血病密切相关的基因，并研究它们在白血病发生和发展中的作用机制，对于开发潜在更有效的治疗试剂具有重要意义。

外源性逆转录病毒感染宿主细胞时，可将其DNA整合到宿主细胞的基因组中。在人生殖细胞感染的情况下，插入的逆转录病毒DNA可以随后以孟德尔方式遗传，被称为人内源性逆转录病毒（human endogenous retroviruses ，HERVs)[2]。研究发现内源性逆转录病毒约占人类基因组的8 %[3]。大多数逆转录病毒序列包含框内终止密码子或缺失，使其在体内不能发挥功能。但是一些逆转录病毒仍然具有开放阅读框架（open reading frames，ORF），并保持其潜在的转录能力，对宿主的生理病理过程起着重要的作用[4-6]。合胞素（snycytin）是由HERV-W基因编码的囊膜蛋白，由538个氨基酸组成。2000年Mi等人检测了23种人组织样品，发现合胞素主要在胎盘滋养层细胞中表达，睾丸中少量表达，其他组织基本不表达[7]。合胞素是一个具有细胞融合活性的糖蛋白，通过与其受体SLC1A5/ASCT2/RDR结合促进细胞滋养层细胞融合形成多核合胞体滋养层[8,9]，在胎盘发育过程中发挥着重要作用。目前研究已证实，在人胎盘中合胞素参与细胞融合[10]、细胞周期[11]、细胞凋亡[12]和免疫抑制[13]等生理过程。另一方面， 合胞素在一些胎盘病变中表达异常，如先兆子痫[14]、特发性胎儿生长受限[15]、妊娠糖尿病[16]等。同时，人们还发现合胞素在乳腺癌[17]、子宫内膜癌[18]、皮肤T细胞淋巴瘤[19]、黑色素瘤[20]等肿瘤中有表达，且合胞素的表达水平可作为乳腺癌的一个预后因子[17]；合胞素在子宫内膜癌中表达升高，可通过调控细胞间的融合促进肿瘤增殖[18]；参与介导乳腺癌细胞和口腔鳞状细胞癌细胞与内皮细胞之间的融合[21,22]；可以抑制黑色素瘤细胞B16F10增殖、迁移和侵袭的能力[20]，提示合胞素在肿瘤的发生发展过程中发挥着一定作用，但其具体机制尚不明确。

细胞融合对于胚胎和胎儿发育以及细胞分化非常重要，同时对组织修复和癌症的发生发展也起着重要作用[23]。本研究小组前期研究发现：合胞素在8个白血病或淋巴瘤细胞中都有表达，其表达水平与白血病病人疾病进展相关[24]，且急性骨髓性白血病患者白细胞中的合胞素明显上调[25]，但合胞素在其中发挥的作用尚不清楚。为了明确合胞素与白血病的相关性，我们首先在小鼠淋巴瘤细胞EL4细胞中过表达合胞素，通过观察细胞形态、细胞调亡等生物学特性的变化，探索合胞素是否参与白血病细胞抵抗凋亡及其机制，寻求早期诊断治疗白血病的分子标记或靶点。

材料和方法

1 细胞培养

小鼠淋巴瘤细胞EL4细胞为本实验室液氮保存，细胞在10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基（Gibco）中，37℃，5% CO2培养箱中培养。用常规方法冻存后复苏使用。

2 细胞转染

采用GeneCopoeia公司的慢病毒包装试剂盒Lenti-Pac™ HIV Expression Packaging Kit进行慢病毒包装。加入1ml慢病毒（病毒空载体作为对照）和8μg/ml polybrene到对数生长期的EL4细胞中，感染过夜后更换培养基，最后用嘌呤霉素筛选出稳定表达的细胞系。

3 qRT-PCR

根据Trizol 试剂说明书提取细胞总RNA，逆转录反应体系根据所用试剂盒High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（4368814,ABI）说明书设定，逆转录得到的cDNA利用SYBR Green法对目标基因进行相对定量，其反应体系根据试剂盒Power SYBR Green PCR Master Mix (4367659, ABI）说明书设定，用ABI 7500进行扩增，最后结果用2-△△Ct的方法进行统计。合胞素引物：上游引物5′-ATGCCCCGCAACTGCTATC-3′，下游引物 5′-AGACAGTGACTCCAAGTCCTC-3′，扩增产物大小为112bp。内参基因 GAPDH 上游引物 5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游引物 5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′，扩增产物大小为 233bp。扩增条件为：95 ℃ 2min；95 ℃ 5s；60 ℃ 34s；共 30 个循环；72 ℃继续延伸 5min。

4 Western blot

收集细胞，冰上用单去污剂裂解液裂解细胞5min，随后超声充分碎裂细胞，4 ℃，12000 r/min离心10min，上清即为细胞总蛋白，采取BCA法测定蛋白浓度。取 20μl蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳，最后将蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2h，兔抗合胞素一抗（1∶500；美国Santa公司）4 ℃孵育过夜；TBST洗PVDF膜后 HRP标记的山羊抗兔的二抗（1∶5000；北京中杉金桥生物技术有限公司）室温孵育2 h，TBST洗膜，化学发光剂ECL发光液（Thermofisher scientific，32106）显影，用UVP检测扫描系统（美国UVP公司）检测蛋白表达量，用Image J软件进行光密度分析。

5 细胞凋亡的流式细胞术检测

收集细胞，用PBS清洗离心后，加5μl Annexin V-PE（BD）和10μl 7-AAD（BD）避光孵育10min，随后将细胞置于流式细胞仪(美国BD流式细胞仪FACSCanto II)上检测细胞凋亡，Annexin V-PE和7-AAD阴性者为活细胞，Annexin V-PE阳性和7-AAD阴性者为早期凋亡细胞，Annexin V-PE和7-AAD均阳性者为晚期凋亡细胞或已经死亡的细胞。

6 细胞周期检测

消化细胞后用4℃预冷的250μl PBS轻轻重悬细胞，缓慢加入750μl 冰浴预冷无水乙醇，轻轻吹打混匀-20℃固定过夜，用预冷PBS清洗细胞两次，加入由PI/RNase Staining Buffer周期检测试剂盒（550825, BD）进行染色，用0.5ml PI/RNase染色液缓慢并充分混匀细胞后4℃避光孵育30min。随后将细胞置于流式细胞仪（美国BD流式细胞仪FACSCanto II）上检测，根据所含荧光量进行细胞周期分期。细胞周期G2和M期细胞的DNA含量是G0和G1期细胞的两倍， S期细胞的DNA含量介于这两个极端之间。

7 线粒体膜电位检测

于收集的样品中加入线粒体膜电位检测试剂JC-1（C2006，上海碧云天生物技术有限公司），37℃避光孵育15min，PBS清洗，然后上流式细胞仪检测。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光，用绿色荧光的相对比例来衡量线粒体去极化程度。

8 PKC和Caspase-3活性检测

采用Enzo Life Sciences公司的PKC激酶活性试剂盒（ADI-EKS-420A）进行细胞中的PKC激酶活性检测：用胰酶消化细胞后，离心，用PBS清洗细胞，随后加1 ml试剂盒中的细胞裂解液，冰上静置10min，13000r/min离心15min，取上清用于后续酶活性测定；在相应的酶标板中加检测样品和质控（阳性对照、空白对照、阴性对照）并加入稀释好的ATP 30℃孵育90min；洗板拍干加入磷酸化抗体到每个孔中，孵育30min；洗板拍干加入稀释的辣根过氧化物酶HRP标记抗兔IgG到每个孔中孵育30min；洗板拍干加入TMB显色后加终止液到每个孔中，在450nm测量吸光度。相对激酶活性=（A样-A空）/蛋白含量。

采用Caspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit检测试剂盒（KA0740，美国Abnova公司）检测细胞中的Caspase3酶活性：使用 RIPA裂解液（P0013K，上海碧云天公司）裂解细胞后提取蛋白，加入100μl的RIPA蛋白裂解液，摇匀，置于冰上裂解15min，用细胞刮刀将细胞刮下，并用移液器将裂解液转移至1.5ml Ep管中，随后进行离心，12000r/min, 4℃离心10min，取上清，-20℃保存备用。BCA蛋白测定试剂盒(P0010S)提取样品总蛋白和测定蛋白浓度。根据测定样品的浓度统一将样品稀释成3μg/μl。在酶标板中加入相应的样品（对照孔中用裂解液代替样品），加入10mmol/L的DTT反应缓冲液，每孔补加5μl DEVD—pNA，37℃孵2h，用酶标仪在吸光度405 nm下测定OD值，样品OD值=样品测定OD值-对照OD值。

结 果

1 合胞素稳转EL4细胞系中细胞凋亡增加

为了明确合胞素对细胞凋亡的影响，我们构建了合胞素稳定表达的EL4细胞[26]。首先，对稳转细胞系EL4-syncytin中合胞素蛋白（图1A）和mRNA（图1B）的表达情况进行检测，发现与空载对照细胞（EL4-negative，EL4-NEG）和空白对照EL4细胞（EL4）相比，稳转合胞素的EL4细胞中合胞素蛋白（图1A）和mRNA（图1B）水平都显著提高；同时采用流式细胞仪检测稳转合胞素细胞EL4-syncytin和空载细胞EL4-NEG及空白对照EL4细胞中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达率，结果发现慢病毒空载的转染效率达98%，合胞素表达慢病毒的转染效率达42%（图1C，图1D）。

为了了解合胞素对细胞功能的影响，我们首先观察合胞素稳定表达的EL4细胞形态的变化。与对照组细胞（EL4-NEG）相比，稳转细胞（EL4-syncytin）形态学上没有观察到明显差异；随后，利用流式细胞仪检测稳转EL4细胞的凋亡情况发现，与对照组细胞相比，合胞素稳定过表达EL4细胞（EL4-syncytin）的凋亡显著增多（图2），提示合胞素可促进肿瘤细胞凋亡。

2 合胞素过表达促进放线菌酮诱导的细胞凋亡

采用两种不同途径的凋亡诱导剂来诱导凋亡的产生，进一步研究合胞素对不同途径诱导剂诱导凋亡的影响。放线菌素D （actinomycin D，Actin D）抑制mRNA合成从而诱导凋亡产生，放线菌酮（cycloheximide，CHX）抑制细胞蛋白合成从而诱导凋亡产生。用0.5μmoL/L和2μmoL/L Actin D分别诱导3h后，EL4、EL4NEG和EL4syncytin 3组细胞的凋亡率无明显变化（图3、4），而用10μmoL/L和15μmoL/L CHX分别诱导3h后，高表达合胞素细胞的凋亡率增加幅度显著大于其他2组细胞（图3、4）。只有延长0.5μmoL/L和2μmoL/L Actin D诱导时间至6h，高表达合胞素细胞的凋亡率增加幅度才显著大于其他2组细胞，与10μmoL/L CHX诱导6h相似（图5）。由此表明，合胞素对蛋白合成抑制剂CHX诱导的细胞凋亡有明显的协同作用，对mRNA合成抑制剂Actin D诱导的凋亡增效作用不显著。

图1 合胞素稳转EL4细胞系中合胞素的表达水平检测。A，代表性Western blot检测（A1）与统计学分析（A2）；B，syncytin mRNA qRTPCR检测的统计学分析；C，病毒转染效率的代表性流式细胞术检测（C1，EL4组；C2，EL4-NEG组；C2，EL4-syncytin组）；D，流式细胞术检测的病毒转染效率的统计学分析; **P＜0.01（n=3）Fig. 1 The detection of expression level of syncytin in EL4 cells after stable transfection of syncytin. A, representative Western blot result (A1) and statistical analysis (A2); B, statistical analysis of syscytin mRNA detected by qRT-PCR; C, representative results of flow cytometry for virus transfection efficiency (C1, EL4 group; C2, EL4-NEG group; C3, EL4-syncytin group); D, statistical analysis of virus transfection efficiency detected by flow cytometry; **P＜0.01 (n=3)

图2 合胞素过表达对EL4细胞系凋亡的影响。A, 细胞凋亡的代表性流式细胞术检测结果（A1，EL4组；A2，EL4-NEG组；A2，EL4-syncytin组）；B, 流式细胞术检测凋亡的统计学分析；** P＜0.01（n=3）Fig. 2 Effect of syncytin overexpression on apoptosis in EL4 cells. A, representative results of cell apoptosis detected by flow cytometry (A1, EL4 group; A2, EL4-NEG group; A3, EL4-syncytin group); B, statistical analysis of apoptosis detected by flow cytometry; **P＜0.01 (n=3)

3 合胞素过表达后对EL4细胞周期无明显阻滞作用

利用荧光染料碘化丙啶（PI）染色流式细胞术检测细胞周期显示（图6）：稳定过表达合胞素的细胞中细胞周期分布与对照细胞相比没有明显差异，细胞没有明显的被阻滞在某个阶段，因此细胞凋亡的产生并非由于细胞周期阻滞造成。

4 合胞素过表达促进线粒体膜去极化和增强caspase-3活性

凋亡是一种为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，是一种主动的过程，涉及一系列基因的激活、表达及调控。公认的三种信号通路为细胞表面介导的信号途径，线粒体途径和内质网应激途径。为了明确合胞素引起EL4细胞凋亡的信号途径，我们首先用15μmol/L CHX对EL4细胞进行3h凋亡诱导，继续在培养箱培养4 h后，利用线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）检测线粒体膜电位，发现合胞素稳定过表达的EL4细胞中线粒体膜电位去极化效果显著高于两个对照细胞（图7）。PKC激酶活性检测显示，稳定过表达合胞素对PKC激酶活性无明显影响，即使用Actin D和CHX诱导处理后的细胞，PKC激酶活性也没有显著变化（图8A），因此，我们认为合胞素诱导细胞凋亡不是通过PKC途径。最后，我们检测了稳定过表达合胞素对EL4细胞的Caspase-3酶活性的会影响，发现合胞素稳定过表达细胞中的Caspase-3活性显著高于EL4对照细胞和空载体对照EL4；采用不同浓度的Actin D和CHX分别处理3h和6h后，合胞素稳定过表达的EL4细胞中Caspase-3活性显著高于对照组细胞，且随着诱导时间的增加Caspase-3活性也逐渐增强(图8B)。以上结果表明，合胞素可以增强CHX凋亡诱导剂的作用，且合胞素可能通过使线粒体膜去极化进而激活Caspase-3途径，从而诱导白血病细胞EL4凋亡。

图3 合胞素过表达对放线菌素D（Actin D）与放线菌酮（CHX）诱导（3h）EL4细胞凋亡影响的流式细胞术检测Fig. 3 Flow cytometry detection for the effect of overexpression of syncytin on apoptosis induced by actinomycin D (Actin D) or cycloheximide (CHX)for 3h

讨 论

白血病是一个高死亡率和高复发率的造血系统恶性肿瘤。近年来，随着遗传学，分子生物学和测序技术的快速发展，已经对白血病的发病机理进行了更深入的了解。化疗方案和支持治疗的改进，以及广泛使用新型药物和造血干细胞移植已显着改善患者的预后和预后。然而，仍有越来越多的年轻患者死于白血病[27]。此外，随着工业发展等因素的推移，白血病的发病率呈逐年上升趋势[28]。因此深入研究白血病的分子机制，获得更多生物标志物或治疗的新目标显得尤为重要。

图4 流式细胞术检测合胞素过表达对放线菌素D（Actin D）与放线菌酮（CHX）诱导（3h）EL4细胞凋亡影响的统计学分析。**P＜0.01（n=3）Fig. 4 Statistical analysis of flow cytometry detection for the effect of overexpression of syncytin on apoptosis induced by actinomycin D (Actin D) or cycloheximide (CHX) for 3h. **P＜0.01 (n=3)

图5 合胞素过表达对放线菌素D（Actin D）与放线菌酮（CHX）长时间诱导（6h）EL4细胞凋亡的影响。A，代表性流式细胞术检测结果；B，统计学分析；**，P＜0.01（n=3）Fig. 5 Effect of syncytin overexpression on apoptosis induced by actinomycin D (Actin D) or cycloheximide (CHX) for 6h. A, representative results of flow cytometry; B, statistical analysis; **, P＜0.01 (n=3)

图6 合胞素过表达对EL4细胞周期影响的PI染色流式细胞检测。A，代表性流式细胞术检测结果（A1，EL4组；A2，EL4-NEG组；A2，EL4-syncytin组）；B，3次实验结果的统计学分析Fig. 6 PI staining flow cytometry detection for the effect of syncytin overespression on cell cycle of EL4 cells. A, representative results of flow cytometry (A1, EL4 group; A2, EL4-NEG group; A3, EL4-syncytin group); B, statistical ananlysis of 3 experimental results

图7 合胞素过表达对EL4细胞线粒体膜电位去极化影响的JC-1流失细胞数检测。A，代表性JC-1流式细胞术检测结果（A1，EL4组；A2，EL4-NEG组；A2，EL4-syncytin组）；B，统计学分析（**P＜0.01, n=3）Fig. 7 JC-1 flow cytometry detection for the effect of syncytin overexpression on the depolarization of mitochondrial membrane potential in EL4 cells. A, representative results of JC-1 flow cytometry detection (A1, EL4 group; A2, EL4-NEG group; A3, EL4-syncytin group); B, statistical analysis

图8 合胞素过表达对EL4细胞PKC活性和Caspase-3活性的影响。A，PCK活性的统计学分析（n=3）；B，Caspase 3活性的统计学分析（n=3）；** P＜0.01Fig. 8 Effect of syncytin overexpression on activities of PKC and Caspase 3. A, statistical ananlysis of PKC activity (n=3); B, statistical analysis of caspase-3 activity (n=3); **P＜0.01

我们前期证实合胞素表达水平与白血病病人疾病进展相关[24]，且在急性骨髓性白血病患者白细胞中明显上调[25]，说明合胞素在白血病的发生发展过程中起着重要作用。本实验中，我们首次证实了合胞素过表达可引起白血病细胞凋亡，并且可增强放线菌酮诱发的细胞凋亡，另一方面，我们证实了合胞素过表达可引起线粒体膜电位去极化，进一步释放促凋亡蛋白，激活caspase通路，最终引起线粒体途径细胞凋亡。放线菌酮可通过抑制真核细胞蛋白的合成进而诱发细胞凋亡，以往研究发现：放线菌酮处理可引起线粒体结构或形态的异常如肿胀、线粒体嵴紊乱或空化等[29]，而细胞凋亡过程中会导致或加剧线粒体结构的异常[30]，因此我们认为syncytin稳定过表达之后可诱导细胞线粒体途径凋亡，同时会增强其他损害线粒体试剂如放线菌酮诱发的细胞凋亡，这为联合用药提供了新的可能。

先兆子痫与胎盘缺氧和合胞体滋养层形成缺陷有关，已经证明低氧通过降低合胞素的表达水平来抑制滋养层细胞融合[31]。先前有报道发现先兆子痫中GCM1的表达量降低[32]，并且低氧有可能导致GCM1的下降[33]，因此，缺氧抑制GCM1是否能抑制合胞素的表达有待进一步研究。同时，白血病中低氧诱导因子HIF的过表达和稳定与缺氧骨髓微环境之间协同作用促进疾病进展，耐药性和复发[34]，那能否通过干预合胞素从而影响白血病的耐药与复发以及疾病的进展值得进一步的探索。

在本研究中，我们发现合胞素可诱导小鼠淋巴瘤细胞EL4细胞线粒体途径细胞凋亡。本研究结果对解释人类内源性逆转录病毒基因参与白血病发病机制，寻找白血病的诊断和药物治疗的新靶点具有重要的意义。