杜之正 黄旭建 孙 云 吴亮宇

(福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002)

1 引言

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶叶中含量最高的儿茶素类单体，具有抗癌[1]、消炎[2]、抗氧化[3]、抗辐射[4]和预防心血管疾病[5]等保健功效，因此EGCG在功能性食品开发方面具有较强的应用价值。目前研究表明，EGCG的稳定性和生物利用率会受环境pH值、温度和各种酶类的影响。当pH>6的时候，水溶液中的EGCG会迅速降解[6, 7]；而当环境温度超过40℃时，EGCG会快速差向异构化[8]；而生物体内的各种酶类，尤其是小肠等消化器官中的消化酶，也可降解EGCG[9]。已有研究显示，在EGCG中加入乳蛋白、维生素C、米糠蛋白，以及通过纳米包埋等，均可提高EGCG的稳定性[10-13]。

余甘，是广泛种植于中国热带和亚热带地区的一种植物，其果实是传统中药重要的配伍成分，具有抗氧化[14]、消炎杀菌[15]、提高免疫力[16]，保护心血管[17]等功能。近年来，对余甘果的研究较多地集中在其医药和营养价值开发方面[18, 19]。而作为一种药食同源的材料，余甘果集生物相容性、功能性和来源广泛等特点于一身[20]，可以用作功能性食品开发的载体成分。目前，以余甘果为载体的EGCG复合物的开发和利用还未见报道。前期研究显示，以酸、碱、有机溶液对生物质材料进行改性和洗涤，可以脱除大量可溶性物质(小分子的多糖、蛋白、次生代谢物等)，增加生物质材料的表面吸附位点，从而提高其对其它生物活性物质的吸附能力[21-24]。本研究以氢氧化钠-盐酸改性处理后的余甘果为吸附剂，对水溶液中的EGCG进行吸附处理，通过吸附动力学和等温吸附研究，探索其作为EGCG载体的可行性，为今后EGCG生物利用率的提高打下基础。

2 材料与方法

2.1 试剂

EGCG购自湖州四丰生物技术公司，纯度≥95%。EGCG标准样购于Sigma-Aldrich公司。其它化学试剂为分析纯，购于国药集团。去离子水由盈科供水系统提供。

2.2 余甘果样品

余甘果采购自福州当地市场。将购置的余甘果洗净，粉碎机(FW177型, 泰斯特仪器有限公司，天津)粉碎。在室温下，将得到的粉碎样品进行酸碱改性处理：将粉碎后的余甘果置于布氏漏斗，加入0.1 M的氢氧化钠，在Waterman 3号滤纸上进行抽滤，直至滤液pH值稳定；再加入去离子水洗涤，直至滤液达到中性；再用0.1 M的盐酸进行酸洗并抽滤，直至滤液pH值稳定，再用去离子水进行洗脱，滤液达到中性后，得到氢氧化钠-盐酸改性处理后的余甘果，贮藏于-20 ℃冰柜，待用。

2.3 吸附动力学研究

将改性后的余甘果粉末用去离子水清洗，布氏漏斗过滤(Whatman3号滤纸)，待用，其含水率用MA-30型含水率测定仪(Sartorius，德国)测定。取湿重为2.0 g的改性余甘果粉末置于锥形瓶中，然后加入200 mL的EGCG溶液(初始浓度为200 mg/L)，将瓶口密封后置于25 ℃水浴摇床(100 rpm)进行吸附，在吸附过程进行的第5，10,15,30,60,120,240，480和1440 min取上清液样品1 mL，将上清液在4 ℃，10000 rpm的离心机中离心10 min，样品中的EGCG浓度用HPLC分析。用公式(1)计算，在吸附反应进行的时间t (min)时，EGCG被处理后的余甘果吸附的量qt(mg/g)：

(1)

公式中，C0和Ct(mg/L)是EGCG溶液初始浓度和吸附反应进行了t时间后的浓度。V(L)为吸附体系体积。W (g)是所用余甘果的干重。为了研究吸附动力学特性，将实验得到数据分别代入拟一级动力学(2)和拟二级动力学(3)方程：

ln(qe-qt)=lnqe-k1t

(2)

(3)

公式中，qt和qe(mg/g) 分别是吸附体系中时间t时和吸附平衡时余甘果的吸附率； k1(min-1) 和 k2(g mg-1min-1) 分别是拟一级动力学和拟二级动力学方程反应速率常数。

2.4 等温吸附实验

将改性后的余甘果粉末用去离子水清洗，布氏漏斗过滤(Whatman 3号滤纸)，待用。其含水率用MA-30型含水率测定仪测定。取湿重为2.0 g的改性余甘果粉末置于锥形瓶中，加入200 mL的EGCG水溶液(EGCG初始浓度分别为50，100，200，400和800 mg/L)，再将锥形瓶放置于转速为100 rpm的水浴摇床，温度分别为25，40和55 ℃，吸附反应时间为1440 min。达到平衡后取上清液1 mL，4 ℃，10000 rpm离心10 min，样品中的EGCG浓度由HPLC检测得出。平衡时单位余甘果吸附EGCG的量qe(mg/g)，同样可以由公式(4)算得：

(4)

C0和 Ce(mg/L)分别是初始和吸附平衡时EGCG的浓度；V(L)是吸附体系体积；W(g)是所用余甘果干重。

2.5 等温吸附模型

实验数据采用Langmuir和Freundlich吸附模型进行分析。Langmuir公式如下：

(5)

Ce(mg/L)是吸附体系达到平衡时溶液中游离态EGCG的浓度，qe(mg/g)为吸附体系达到平衡时单位重量余甘果吸附的EGCG的量。Qm(mg/g)是理论最大吸附值，KL(L/mol)是Langmuir平衡常数。Freundlich公式如下：

(6)

Freundlich常数1/n是与吸附体系均一性相关的常数，KF(mg/g (mL/mg)1/n)是吸附剂的吸附效率。

2.6 吸附热力学研究

热力学常数标准吉布斯自由能变(ΔGo)、焓变(ΔHo)、熵变(ΔSo)可以指示反应的自发性，可以通过公式(7)算得

ΔGo=-RTlnKa

(7)

Ka是热力学平衡常数，T(K)为反应进行的温度，R是气体常数，为8.314 J/mol/K。根据前人研究[25]，在中性或弱电性吸附质为主的吸附体系中，热力学平衡常数Ka可以被Langmuir平衡常数(KL)替代，因此公式(7)可以变换为公式(8)：

ΔGo=-RTlnKL

(8)

根据Van’t Hoff方程(9)，可以算出标准状态焓变(ΔHo)和熵变(ΔSo)：

(9)

2.7 HPLC分析

HPLC系统每个样品进样体积为10 μL，采用VYDAC的C18反向柱，柱温28 ℃，流动相A为乙腈+0.08%三氟乙酸，流动相B为水+0.1%三氟乙酸，梯度变化为：2% A：98% B 至24% A：76% B 持续45 min，然后变为 2% A：98% B持续5 min。流速 200 μL/min，检测波长为280 nm。

2.8 统计分析

每个处理设3个重复。实验数据采用Origin 8.0(Origin Lab Inc)进行统计分析。

3 结果与讨论

3.1 吸附动力学研究

在25 ℃下，经过氢氧化钠-盐酸改性处理后的余甘果粉末对EGCG的吸附动力学曲线如图1(A)所示。余甘果粉末对EGCG的单位吸附量(qt)随着吸附时间的延长而呈现对数增长趋势。吸附开始后的前30 min内显示出了快速增长趋势；而在吸附后期(120～1440 min)出现了平台型，表明吸附基本达到动态平衡。说明，在吸附初始阶段，余甘果粉末表面有大量的可吸附位点，因此在吸附初期的吸附量增速较大。随着反应的进行，由于吸附剂表明可吸附位点的减少，同时吸附体系中游离态EGCG分子的减少，已吸附EGCG与游离态的EGCG之间排斥力等因素综合作用下，吸附效率开始下降。

图1 改性余甘果粉末对EGCG吸附的动力学曲线(A)，拟一级动力学拟合曲线(B)和拟二级动力学拟合曲线(C)。EGCG起始浓度为200 mg/L。

将实验所得数据代入拟一级和拟二级动力学模型进行拟合，拟合后得到拟一级和拟二级动力学曲线(图1，B和C)，拟合所得参数列于表1。结果表明：拟二级动力学拟合所得相关系数(0.99)大于拟一级动力学拟合结果(0.84)，且由拟二级动力学预测的qe值(qe.cal)，相较于拟一级动力学预测值，更接近于实验所得数值(qe.exp)，说明拟二级动力学模型更适用于描述改性余甘果粉末对EGCG的吸附过程，这一结果与前人利用PVPP吸附茶儿茶素类物质时所得动力学结果分析一致[26]。此外，余甘果粉末对EGCG的吸附过程中经历3个阶段：

(1)初始阶段中吸附质(EGCG)分子通过外部边界大量转移至吸附剂(改性余甘果粉末)，这一阶段也叫膜扩散阶段；

(2)第二阶段是由吸附质分子通过孔隙在吸附剂中扩散，也称为粒子内扩散；

(3)第三阶段是吸附质表面可吸附位点上吸附质的交换；

表1 改性余甘果粉末对EGCG吸附动力学的拟一级和拟二级动力学模型拟合参数

*qe.exp,为实验数据；qe.cal,为模型拟合数据；相对误差=100×(|拟合数据-实验数据)/实验数据

由于第三阶段吸附速度快，时间短，所以基本上吸附过程是由膜扩散和粒子内扩散为主导的[27-28]。

3.2 等温吸附研究

等温吸附是用于描述在给定温度条件下，吸附体系平衡时吸附剂的吸附率(qe)和吸附质初始浓度(Ce)之间的关系。图2(A)展示了改性余甘果粉末对EGCG吸附率和EGCG初始浓度之间的关系。

余甘果的平衡吸附率随着初始EGCG浓度的增加而升高，推测这一现象是由以下原因造成：

(1)随着初始EGCG浓度的提高，余甘果粉末表面未被占据的吸附位点会被越来越多的EGCG分子包围，这导致了更多的EGCG分子能克服表面张力，吸附在余甘果粉末表面；

(2)更高的初始EGCG浓度意味着更多的游离态EGCG分子通过吸附质孔隙扩散至吸附剂内部，这样使得单位质量吸附剂的吸附量上升；

Langmuir等温吸附模型用于描述在给定温度下单分子层的吸附过程，而Freundlich等温吸附模型则用于描述在给定温度下多分子层的吸附过程。本研究通过这两种模型描述了改性余甘果粉末吸附EGCG的过程，拟合曲线如图2(B和C)所示，这两种吸附模型的参数列于表2，结果表明：这两种模型均可以用于描述改性余甘果粉末吸附EGCG的过程(R2≥0.92)，吸附过程受初始EGCG的浓度和吸附剂表面未吸附位点数量共同作用的影响[29]。在Langmuir模型预测结果中，在较高温度情况下，改性余甘果粉末具有较高的吸附率。这一趋势也在Freundlich模型中的KF值得到验证。表2中，KF值没有量纲，不具有物理学意义，只是吸附率的指征。

图2 不同温度条件下，改性余甘果粉末对EGCG等温吸附曲线(A)，Langmuir拟合曲线(B)和Freundlich拟合曲线(C)。原点为25 ℃，方块为40 ℃，三角形为55 ℃。

3.3 吸附的热动力学研究

吸附反应的标准吉布斯自由能变(ΔGo)，焓变(ΔHo)和熵变(ΔSo)计算值列于表3。改性处理后的余甘果粉末吸附EGCG反应的ΔGo值均小于0，表明这余甘果粉末吸附EGCG的反应是自发进行的；而各值之间极为接近，说明反应的自发性对于反应的温度是独立的[30]。当 ΔHo的绝对值在 2.1～20.9 kJ/mol时，反应由物理吸附占主导；而当ΔHo的绝对值在 80～200 kJ/mol时，反应由化学反应占主导[31-32]。本研究中，改性余甘果粉末吸附EGCG反应的ΔHo值为7.63 kJ/mol，表明反应是吸热反应，且反应过程是由物理吸附为主导的，吸附剂与吸附质分子间的范德华力是吸附过程的主要驱动力。反应的ΔSo值与液相/固相表明的吸附质相关，而ΔSo值大于0，说明反应的混乱度增加，可能是由于吸附剂表面的水分子被EGCG取代所致[26,33-34]。

表2 改性余甘果粉末吸附EGCG的Langmuir和Freundlich模型拟合参数

表3 改性余甘果粉末对EGCG吸附的热力学参数

4 结论

本文研究了氢氧化钠-盐酸处理的余甘果粉末对EGCG的吸附特性，结果显示，EGCG溶液初始浓度会影响改性余甘果粉末的吸附率，而反应温度的升高也会增加余甘果粉末对EGCG的吸附率。Langmuir和Freundlich等温方程均可以描述这一体系的吸附反应过程。热力学分析表明，吸附反应是一个吸热、自发的过程，且反应过程是由物理吸附占主导地位。研究结果说明，改性余甘果粉末可作为EGCG复合物载体应用。