孙庆扬,赵 悦,杨雪峰,何霞红*

(1.云南农业大学 农业生物多样性应用技术国家工程研究中心,云南 昆明 650201;2.中粮华夏长城葡萄酒有限公司,河北 昌黎 066600)

苹果酒是一种以鲜榨苹果汁或浓缩苹果汁为原料经发酵酿制而成的低度型饮料酒[1]。苹果酒不仅较多地保留了苹果中原有的大部分营养物质,同时还具有柔和的醇香和酯香,因而为国内外消费者所喜爱[2]。在全球范围内,苹果酒的年产量仅次于葡萄酒,是国际饮料酒市场的一大热点果酒[3]。

在目前果酒的酿造过程中,二氧化硫几乎是不可缺少的一种辅料,其在酿造过程主要起抑菌和抗氧化等重要作用[4]。由于苹果汁富含酚类物质,其在多酚氧化酶的作用下极易发生褐变[5],因此在苹果酒酿造过程中需要添加相对较多的二氧化硫来抑制多酚氧化酶的活性,从而达到防止果汁褐变的效果[6]。虽然苹果汁的褐变可在发酵成苹果酒的过程中得到一定的改善,但综合考虑二氧化硫的抑菌和抗氧化效果,其添加量也要达到70～90 mg/L[7]。添加过多的二氧化硫一方面会影响发酵过程中酵母菌[8-9]和乳酸菌[10]的正常代谢;另一方面,摄入较多的二氧化硫还会对人的健康,特别是过敏人群,造成严重的影响[11]。因此,有研究者尝试通过改进发酵条件和使用二氧化硫替代物[12-13]等实现一些果酒的“减硫法”[14-15]乃至“弃硫法”酿造[16-17]。但关于该方法在苹果酒酿造过程中的应用及对苹果酒中挥发性香气物质影响的研究很少涉及。

本研究以小国光苹果为试验材料,采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法(headspace solid-phase microextraction-gaschromatography-massspectrometry,HS-SPME-GC-MS)测定“减硫法”和常规法酿造的苹果酒中的挥发性香气物质,探究“减硫法”酿造对苹果酒中挥发性香气物质的影响,以期为苹果酒酿造过程中二氧化硫的合理使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果酒酿造所使用的原料为小国光,产地为河北省秦皇岛市青龙县,果汁平均含糖量为128 g/L;酿酒酵母X16、LAFAZYMREXTRACT果胶酶(使用量5～10 g/100):法国LAFFORT公司;焦亚硫酸钾为WINY:意大利Enartis公司。

3,5-二硝基水杨酸(dinitrosalicylic acid,DNS)(分析纯)、4-甲基-2-戊醇(纯度98%):美国Sigma Aldrich公司;氢氧化钠(分析纯):上海市四赫维化工有限公司;氯化钠(分析纯):国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器与设备

Unico 7200型可见分光光度计:Unico(上海)仪器有限公司;SPME手动进样手柄、DVB/CAR/PDMS复合萃取头(50/30 μm):美国Supelco公司;GC/7890B-MS/5977A气相色谱-质谱联用仪、DB-WAX毛细管柱:美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 苹果酒酿造工艺流程及操作要点

操作要点:原料经过筛选,剔除残次、霉烂、病虫等不良果实,随后进行破碎榨汁(*添加焦亚硫酸钾,其中“减硫法”酿造添加量为100 mg/L;常规法酿造添加量为200 mg/L),果汁入罐(60 L)并添加果胶酶(20 mg/L)澄清,24 h后澄清汁接种酵母(200 mg/L,40℃活化30 min后添加),20℃控温酒精发酵,待发酵结束(残糖量低于4 g/L),需分析检测的原酒置于密封容器中于-20℃贮存。

1.3.2 苹果酒理化指标测定

苹果酒中各项基本理化指标进行测定参考国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》,并稍作改进。酒精度采用密度瓶法测定;还原糖含量采用DNS比色法测定;总酸含量(以苹果酸计)采用电位滴定法测定;挥发酸含量(以乙酸计)采用水蒸气蒸馏-滴定法测定。

1.3.3 苹果酒挥发性香气物质测定

苹果酒中挥发性香气化合物采用顶空固相微萃取-气质联用法(HS-SPME-GC-MS)测定。

样品预处理:准确量取6.000 mL苹果酒样品于15 mL固相微萃取瓶中,加入1.50 g NaCl、质量浓度为2.00 g/L的4-甲基-2-戊醇(内标物)20μL和一枚磁子,立即用带有聚四氟乙烯垫片的盖子盖紧,将样品瓶置于固相微萃取平台上,加热温度为45℃,预热10 min。然后用固相微萃取头在45℃加热条件下萃取吸附50 min,待吸附平衡后迅速将萃取头插入气相色谱进样口,推出纤维头热解吸10min,同时进行质谱分析。

气相色谱条件:挥发性物质分离采用DB-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm);升温程序:初始温度40℃保持2 min,随后以3℃/min的速度升至85℃,保持2 min,再以3℃/min的速度升至120℃,并保持3min,再以3℃/min升至200℃,最后以5℃/min升至230℃,保持10 min。载气为氦气(He)(纯度99.999%),流速:1.0 mL/min。不分流进样。

质谱条件:采用电子电离(electronic ionization,EI)源,电子能量为70 eV,检测器温度250℃,离子源温度为230℃,全扫描模式,扫描范围:30～400 m/z,无溶剂延迟。

1.3.4 挥发性化合物的定性定量分析

挥发性香气物质采用气相色谱-质谱联用仪进行分析、鉴定,通过检索美国国家标准与技术研究所(national institute of standards and technology,NIST)14质谱库进行初步检索和分析,同时结合保留指数和相关文献进行谱图人工解析,确定各个挥发性物质的化学成分,并对所鉴定出的挥发性香气物质采用内标峰面积比值法进行定量,其计算公式如下:

1.3.5 数据分析

每组样品各指标进行三组平行测定,采用SPSS19.0软件进行数据处理与分析(独立样本T检验,α=0.05,双尾检验)。

2 结果与分析

2.1 “减硫法”和常规法酿造苹果酒基本理化指标分析

“减硫法”和常规法酿造苹果酒的各项基本理化指标如表1所不。由表1可知,与常规法酿造相比,“减硫法”酿造的苹果酒中还原糖含量略高为1.94 g/L,相应的酒精度略低为7.40%vol,同时,“减硫法”酿造的苹果酒干浸出物也略高为18.96 g/L。虽然两种酿造方法的苹果酒pH值差异不大(分别为3.60和3.63),但“减硫法”酿造的苹果酒中总酸(4.92 g/L)和挥发酸(0.31 g/L)含量则稍高于常规法酿造(4.59 g/L和0.25 g/L)。

表1 “减硫法”和常规法酿造苹果酒的基本理化指标Table1 Basic physicochemical indexes of cider brewed by'sulfur reduction method'and normal method

2.2 “减硫法”和常规法酿造苹果酒中挥发性香气物质分析

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法,对“减硫法”和常规法酿造苹果酒中挥发性香气物质进行吸附、萃取、分离和分析,结果如表2所不。由表2可知,“减硫法”和常规法酿造苹果酒中共检测到挥发性香气物质66种,包括15种醇类、30种酯类、7种脂肪酸类、3种酮类、6种芳香族类、3种萜烯类、和2种其他类。

表2 “减硫法”和常规法酿造苹果酒中挥发性香气物质GC-MS分析结果Table2 GC-MS analysis results of volatile aroma compounds in cider fermented by'sulfur reduction method'and normal method mg/L

续表

2.2.1醇类

高级醇是酵母酒精发酵的次生代谢物,其生成量受多种因素影响。高级醇的形成途径主要有两条,即生物合成途径和Ehrlich途径,其都是在发酵过程中,酿酒酵母通过相应α-酮酸的脱羧作用生成[18-19]。高级醇通常具有强烈的刺激性气味,在较低的浓度时这类物质可以增加果酒香气的复杂性;但在较高浓度下则会对果酒的香气产生负面影响[20]。

“减硫法”和常规法酿造的苹果酒中分别检测到14种和15种高级醇类物质,且常规法酿造苹果酒中多数高级醇类物质含量显著高于“减硫法”酿造(P＜0.05)。在检测到的15种醇类中,异戊醇在两种方法所酿苹果酒中含量均较高,其含量可达高级醇类物质总量的78%以上,为苹果酒中最重要的高级醇类物质,且其在常规法酿造的苹果酒中含量为44.08 mg/L,高出“减硫法”酿造苹果酒约50%。虽然多数高级醇类物质在常规法酿造的苹果酒中较高,但“减硫法”酿造的苹果酒中具有柑橘和橙样香气的正庚醇(0.33mg/L)和正壬醇(0.54 mg/L)的含量则极显著高于常规法酿造(P＜0.01)。而具有奶油样香气是2,3-丁二醇是果酒中为数不多能够呈香的多元醇[2],其在“减硫法”酿造的苹果酒中含量也高于常规法。除上述高级醇类物质外,两种方法酿造的苹果酒中还检测到一种硫醇类物质,即3-甲硫基丙醇,该物质具有类似圆葱的香气,其在常规法酿造苹果酒中要高于“减硫法”酿造。另外,在常规法酿造苹果酒中还检测到有少量的顺-5-辛烯-1-醇。

2.2.2 酯类

果酒中的酯类香气物质主要是具有花果类香气的乙酸酯和脂肪酸乙酯,它们对果酒的香气起着极其重要的作用,是果酒中果香最主要的来源[21]。

“减硫法”和常规法酿造的苹果酒中共检测到30种酯类物质,其中“减硫法”酿造苹果酒中乙酸酯9种、乙基酯11种、其他酯9种;“减硫法”酿造苹果酒中乙酸酯6种、乙基酯11种、其他酯7种。采用“减硫法”酿造的苹果酒中乙酸酯类、乙基酯类和其他酯类物质总量均高于常规法酿造苹果酒。

“减硫法”酿造的苹果酒中具有愉快的果香的乙酸丁酯的含量(14.36 mg/L)是常规法酿造苹果酒的2.6倍;而具有花香和果香的乙酸苯乙酯的含量(2.18 mg/L)常规法酿造苹果酒是“减硫法”含量的近3倍。乙酸异戊酯具有香蕉的香气,其含量可达乙酸酯总量的53%以上,且常规法酿造的苹果酒中乙酸异戊酯的含量极显著高于“减硫法”酿造的苹果酒(P＜0.01),此外,该物质在两种方法所酿苹果酒中的含量与异戊醇的含量还具有明显的相关性。乙酸乙酯和乙酸异丁酯都具有明显的水果香气,它们在两种方法酿造的苹果酒中的含量无明显差异(P＞0.05)。另外,与常规法酿造的苹果酒相比,“减硫法”酿造的苹果酒中还含有少量的乙酸叶醇酯以及微量的乙酸异辛酯和3-甲硫基丙醇乙酸酯。

在“减硫法”酿造的苹果酒中多数乙基酯,特别是在乙基酯总量中占有较大比例的己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量均显著高于常规法酿造的苹果酒(P＜0.05),仅有2-甲基丁酸乙酯和反式-4-癸烯酸乙酯在常规法酿造的苹果酒中含量稍高。另外,具有甜果香的丁酸乙酯和具有淡雅黄油香的乳酸乙酯则分别仅在常规法和“减硫法”酿造的苹果酒中检测到。

除上述各种乙酸酯和乙基酯外,两种方法酿造的苹果酒中还检测到9种其他酯类物质。其中,辛酸甲酯(柑橘香)、癸酸甲酯(烟草香)和辛酸-3-甲基丁酯在“减硫法”酿造的苹果酒中含量均高于常规法酿造的苹果酒。此外,与常规法酿造相比,“减硫法”酿造苹果酒中还额外检测到两种酯类物质,即己酸异戊酯和丁二酸二乙酯。

2.2.3 脂肪酸类

果酒中的挥发性脂肪酸类主要为果酒提供乳酪和脂肪类香气,其主要来源于酒精发酵,并受发酵条件、发酵营养和所用酵母的影响[22]。“减硫法”和常规法酿造的苹果酒中共检测到的7种挥发性脂肪酸,其中丁酸、辛酸和9-癸烯酸在常规法酿造的苹果酒中的含量均高于“减硫法”酿造的苹果酒,而乙酸、己酸和癸酸在两种方法酿造的苹果酒中的含量并无明显差异(P＞0.05)。另外,2-甲基丁酸也仅在“减硫法”酿造的苹果酒中检出。

2.2.4 酮类

除种类和含量均比较丰富的醇类、酯类和脂肪酸类物质外,“减硫法”和常规法酿造的苹果酒中还检测到3种酮类物质。其中,具有薄荷香的二异丁基酮在“减硫法”酿造苹果酒中的含量极显著高于常规法酿造苹果酒(P＜0.01)。此外,“减硫法”酿造苹果酒中还检测到微量的4,4-二甲基-2-环戊烯-1-酮。

2.2.5 芳香族类

以酿酒原料中的苯丙氨酸为底物,经转氨和脱羧作用可形成多种芳香族类化合物[23]。其中,苯乙醇作为最重要的芳香醇对多种果酒的特征香气具有重要影响[24-25]。

与常规酿造相比,虽然“减硫法”酿造的苹果酒中该类香气物质的种类较多,但在常规法酿造的苹果酒中所检测到的香气物质的含量则均高于“减硫法”酿造,特别是具有蜂蜜和玫瑰花香的苯乙醇的含量为16.87 mg/L,极显著高于“减硫法”酿造的6.00 mg/L(P＜0.01),同时其含量与乙酸苯乙酯含量也具有相关性。此外,采用两种酿造方式的苹果酒中还检测到两种挥发性酚类物质,分别为2-乙基苯酚和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚。其中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚具有烘烤香和坚果香,对多种类型果酒的香气均具有重要贡献,该物质在“减硫法”和常规法酿造的苹果中含量分别为0.19 mg/L和0.24 mg/L。

2.2.6 萜烯类

萜烯类物质大多以糖苷结合态形似存在于酿酒原料,通常具有优雅的花香和果香[26],但也有研究表明其可由微生物合成[27]。萜烯类物质的阈值通常相对较低,它们对果酒的花香和果香有着直接或协同的贡献作用[28]。

“减硫法”和常规法酿造的苹果酒中共检测到3种萜烯类物质,且这类物质的种类和含量均在常规法酿造的苹果酒中较多(高)。在“减硫法”酿造的苹果酒中所检测的萜烯类物质仅有β-大马士酮(玫瑰花香),其含量为0.98 mg/L,极显著低于常规法酿造的2.05mg/L(P＜0.01)。由于萜烯类物质结构不稳定,其可受外界因素影响发生氧化、还原、聚合、环化以及分子重排等反应导致结构的改变,从而影响这类物质的检测[28];此外,在不同的酿酒原料中,萜烯类物质的种类、含量以及与之结合的糖苷均有一定的差异[29],这些都是所酿果酒中萜烯类物质产生差异的原因。

2.2.7 其他类

“减硫法”和常规法酿造苹果中还检测到2种其他类香气物质,分别为甲氧基苯基肟和2,3-二氢苯并呋喃。其中,甲氧基苯基肟存在于多种植物[30]及发酵制品[31-32]中,由此推断其可能来源于酿酒原料以及发酵过程。由表2可知,“减硫法”酿造的苹果酒中甲氧基苯基肟含量为0.44mg/L显著高于常规法酿造的0.19mg/L(P＜0.05)。另外,2,3-二氢苯并呋喃在两种方法酿造的苹果酒中均有检出,并且具有相似的含量。

3 结论

本研究以小国光苹果为试验材料,采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法对“减硫法”和常规法酿造的小国光苹果酒中的挥发性香气物质进行测定和分析。结果表明:“减硫法”和常规法酿造苹果酒中共检测到挥发性香气物质66种,包括15种醇类、30种酯类、7种脂肪酸类、3种酮类、6种芳香族类、3种萜烯类和2种其他类。与常规法酿造相比,“减硫法”酿造有助于提升苹果酒中酯类物质,特别是具有丰富果香和花香的乙基酯类物质的含量,同时还能有效降低苹果酒中的高级醇,特别是具有酒精味和溶剂味的异戊醇的含量。但“减硫法”酿造会降低苹果酒中脂肪族类、芳香族类和萜烯类物质的含量,造成苹果酒中乳酪香、烘烤香和部分花香的减弱。采用“减硫法”酿造对苹果酒中各项基本指标略有影响,适当减少二氧化硫的使用量可在一定程度上改善苹果酒的香气品质。