程方方,武 运*,武亚婷,王犁烨,殷 娜,刘维兵,韩婷婷,古丽娜孜

(新疆农业大学 食品科学与药学学院,新疆 乌鲁木齐 830052)

我国发酵辣椒酱历史悠久,但大多采用自然发酵法。自然发酵法存在诸多问题[1],主要表现为亚硝酸盐积累及品质不稳定难以企业化大生产。辣椒在种植过程中由于化肥的使用导致硝酸盐残留,发酵时一些还原菌将硝酸盐转化为亚硝酸盐。而亚硝酸盐可进一步被杂菌转化为致癌的亚硝酸胺[2-4]。亚硝酸盐形成的根本原因是发酵过程中微生物生长缓慢,腐败菌滋生[5]。因此可以通过筛选降亚硝酸盐能力强、繁殖快的乳酸菌解决此问题。自然发酵法周期长、产品品质受自然条件及菌群结构影响大[6],很难满足工业化大生产的要求。为实现发酵蔬菜行业工业化生产,保证产品风味品质,制备低亚硝酸盐、风味好的产品,人工接种发酵成为了研究热点[7]。辣椒酱发酵过程的微生物体系以乳酸菌为主[8]。新疆地域广阔,生态环境复杂,少数民族众多,这些民族畜牧业及乳制品加工历史悠久,使得新疆传统发酵食品中微生物极为丰富。ISPIRLIH等[9]从酸马乳中筛选出产不同类型胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)的乳酸菌,RONGJ等[10]从酸马乳中筛选出免疫调节性能好的瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus),另外有些研究[11-14]显不,酸马乳中优势细菌为乳杆菌(Lactobaicllus)、坚强肠球菌(Enterococcusdurans)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)等乳酸菌。目前乳酸菌降解亚硝酸盐的人工接种研究多集中于泡菜和酸菜等产品上,适用于发酵辣椒酱的降亚硝酸盐乳酸菌研究较少。

因此,本研究通过从新疆传统食品酸马乳中筛选降解亚硝酸盐能力强、产酸快并发酵辣椒酱风味好的乳酸菌,对筛选菌株进行形态观察、生理生化试验及16SrRNA分析鉴定,并对其进行酸、胆盐耐受性分析,以期为辣椒酱专用发酵剂的开发提供优良菌种,为发酵辣椒酱的纯种发酵及产业化生产奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸马乳:新疆塔城乌苏地区农户用传统方法制作而成;MRS肉汤、MRS琼脂、牛胆盐培养基:北京奥博星生物技术有限责任公司;亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸、硼酸钠、盐酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、氢氧化钠(均为分析纯):天津永晟精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

MJX-100B-Z生化培养箱:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;TU-1810APC分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;LDZX-50KBS高压灭菌锅:上海申安医疗器械厂;LE2002E电子天平、FE28 Plus pH计:梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 乳酸菌的分离纯化

取10 mL酸马奶于90 mL无菌生理盐水中,充分混匀,用无菌生理盐水以10倍梯度稀释至10-6,选取10-3,10-4,10-5和10-6稀释度各0.1 mL涂布于MRS琼脂上,于37℃厌氧培养24 h,随机挑选菌落,转接到MRS琼脂平板上,分离纯化3次,进行革兰氏染色及过氧化氢酶试验,选取接触酶阴性革兰氏阳性菌4℃保存备用。

1.3.2 降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选

将筛选得到的菌于MRS琼脂平板上活化后挑取单菌落接种于10 mL MRS肉汤中37℃培养24 h,取100μL培养液接种到150 mg/L NaNO2的10 mL MRS肉汤中,37℃培养48 h,参考GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中分光光度法测定亚硝酸盐含量。

亚硝酸盐标准曲线的绘制:分别吸取0、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL 150 mg/L NaNO2MRS肉汤置于10 mL棕色容量瓶中。加入4 g/L对氨基苯磺酸溶液2 mL,混匀,静置5 min后加入1 mL 2 g/L盐酸萘乙二胺溶液,加水至10 mL刻度,混匀,静置15 min,以零管校零,于波长538 nm处测定吸光度值OD538nm,绘制亚硝酸钠标准曲线。

样品的测定:吸取适量菌液经0.12μm滤径的注射过滤器过滤,取1 mL滤液于10 mL棕色容量瓶中,后续步骤同标准曲线的操作方法。按照亚硝酸钠标准曲线回归方程计算样品中亚硝酸盐含量。

菌株的亚硝酸盐降解率计算公式如下:

式中:C0为MRS肉汤初始NaNO2质量浓度,mg/L;C1为根据标曲回归方程得出的样品NaNO2质量浓度,mg/L;10为样品稀释倍数。

1.3.3 产酸快的乳酸菌筛选

将筛选得到的菌株于MRS琼脂平板上活化一次后挑取单菌落接种于10 mL MRS肉汤中37℃培养24 h,测定其pH值,筛选产酸快的乳酸菌。

1.3.4 发酵辣椒酱的工艺流程及操作要点

操作要点:食盐5%,蒜4%,接种量2.5%。将鲜辣椒洗净,去蒂及籽切碎,蒜剁碎,称400 g辣椒并加入蒜末、菌液、食盐,装瓶混匀密封,28℃条件下发酵一定时间。第4天开始每天无菌取样进行总酸的测定及感官评价。按照中华人民共和国农业行业标准NY/T 1070—2016《辣椒酱》中规定总酸≤2 g/100 g,根据预试验结果辣椒酱发酵8 d总酸达到2 g/100 g,可认为发酵成熟。

1.3.5 分析检测

发酵辣椒酱总酸含量的测定参照国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法;发酵辣椒酱的感官评价请10人组成的感官评价小组对辣椒酱进行感官评分,取平均值作为评分结果,具体评分标准见参考文献[5]。

1.3.6 菌株鉴定

(1)形态观察及生理生化鉴定

将分离纯化菌株划线接种于MRS琼脂培养基,37℃培养24 h,观察菌株菌落形态,同时进行革兰氏染色镜检观察细胞形态。菌株的生理生化试验参照文献[15-16]及《乳酸菌分类鉴定及实验方法》[17]进行。

(2)16SrRNA鉴定

送至华大基因进行测序,序列结果在美国国家生物技术信息中心(national center of biotechnology information,NCBI)网站用基本地方调整搜寻工具(basic local alignment search tool,BLAST)比对,选取同源性高的模式菌利用MEGA6.0软件邻接法(neighbor-joining,NJ)构建发育树,自展值设定为1 000。

1.3.7 菌株酸和胆盐耐受性研究

(1)菌株酸耐受性测定

将活化好的菌株按2%接种量接种于pH 3.0的MRS肉汤中于37℃培养6 h,取0 h及6 h样品采用倾注法进行计数,测定酸耐受性。

(2)菌株胆盐耐受性测定

将活化好的菌株按2%接种量接种于含0.3%胆盐的MRS肉汤中于37℃培养6 h,取0 h及6 h样品采用倾注法进行计数,测定其胆盐耐受性。

1.3.8 数据处理

利用Excel及Sigmaplot 10.0软件进行数据统计及分析作图。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离纯化

从乌苏市3家农户家中自制的酸马乳中分离出183株菌,按照农户姓氏对菌株进行编号。乳酸菌一般为革兰氏阳性、过氧化氢阴性菌,因此进行革兰氏镜检及过氧化氢酶试验,其中28株菌革兰氏染色为阳性、过氧化氢试验为阴性,可作为初步分离的乳酸菌。

2.2 乳酸菌初筛

2.2.1 亚硝酸盐标准曲线的绘制

以亚硝酸钠质量浓度(x)为横坐标,吸光度值(y)为纵坐标,绘制亚硝酸盐标准曲线如图1所不,所得标准曲线回归方程为:y=0.054 1-0.032 8x,相关系数R2=0.992 1,拟合度较好,能够应用于样品中亚硝酸盐含量的测定。

图1 亚硝酸钠标准曲线Fig.1 Standard curve of sodium nitrite

2.2.2 降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选

所筛28株菌亚硝酸盐降解率见表1。由表1可以看出,28株乳酸菌均具有亚硝酸盐降解能力,但菌株间亚硝酸盐降解能力差异明显(3.60%～88.91%)(P＜0.05),其中有5株乳酸菌亚硝酸盐降解率＞80%,其中菌株C27亚硝酸盐降解率达到88.91%,与已报到[18]的大部分乳酸菌亚硝酸盐降解率(20%～90%)相比较高。本试验选择亚硝酸盐降解率＞50%的9株菌(E47、E18、C7、C17、E14、C55、C27、C3、C11)进行下一步菌株的筛选。

表1 新疆酸马乳中亚硝酸盐降解菌株的初筛Table1 Primary screening of nitrite-degrading strains isolated from Xinjiang kumiss

续表

2.2.3 产酸快的乳酸菌筛选

乳酸菌快速产酸使发酵液pH迅速降低,抑制有害菌[8]是发酵制品的关键技术。产酸速度不仅是筛选优良乳酸菌的重要指标[19],也反应了菌株的繁殖快慢。28株菌培养24 h的pH测定结果见表2。

表2 新疆酸马乳中初筛菌株发酵液24 h时的pH值Table2 pH value of fermentation liquor of primary screening strains isolated from Xinjiang kumiss for 24 h

由表2可知,菌株C18发酵24 h的发酵液pH为4.2,有16株菌的发酵液pH＜4.5。综合产酸能力(筛选标准pH≤4.5)及亚硝酸盐降解能力,最终筛选出菌株E18、C7、C17、E14、C55、C27、C3和C11进行复筛。乳酸菌一般通过产酸和产酶两种途径降亚硝酸盐,本研究中的28株菌中pH在4.2～4.3之间的12株菌,乃有3株菌降解亚硝酸盐能力强(降解率≥80%),这说明不是产酸强的乳酸菌降解亚硝酸盐能力就强,这4株菌降解亚硝酸盐的主要机制可能是酶降解,但还需进一步试验验证。

2.3 乳酸菌复筛

2.3.1 发酵辣椒快的乳酸菌筛选

为了筛选辣椒酱专用菌,将筛选出的菌种接种于辣椒酱进行发酵,根据辣椒酱中总酸含量可以判断菌株发酵辣椒的快慢,本试验将筛选出的8株菌(E18、C7、C17、E14、C55、C27、C3和C11)接种到辣椒酱中发酵8 d,比较各菌株发酵辣椒的能力,结果见图2。从图2可以看出,菌株E18、C17、E14、C27、C3在发酵过程中总酸含量较高(分别为1.93 g/100 g、1.68 g/100 g、1.74 g/100 g、2.15 g/100 g、1.60 g/100 g),所以选择这5株菌进行进一步试验。本研究中自然发酵样品发酵至第8天时总酸含量为1.43 g/100 g,与聂艳辉[8]研究的自然发酵及人工接种发酵第9天总酸含量(1.2～1.6g/100g)结果相同。接种菌株C27的辣椒酱总酸含量一直较高,发酵第8天达到2.15g/100 g,远高于其他筛选菌及自然发酵(比自然发酵高33.5%、比菌株E18高10.2%),同时也远高于罗静等[20]测定的市场上3种发酵辣椒酱发酵第6周总酸(1.6 g/100 g),菌株C27可以明显缩短发酵时间。

图2 发酵辣椒酱中总酸含量的测定结果Fig.2 Determination results of total acid contents in fermented chilisauce

2.3.2 发酵辣椒酱感官评价结果

将筛选出的菌种(E18、C17、E14、C27、C3)接种于辣椒酱进行发酵,结果见表3。由表3可知,5个人工接种的发酵辣椒酱总酸含量均高于自然发酵,同时感官评分也高于自然发酵,说明产酸总量直接影响到辣椒酱的风味及品质,但乳酸的产量与辣椒酱风味并不成线性关系,例如5株菌中菌株E18总酸含量为1.93 g/100 g,感官评分却最低乃有69分。从表3可以看出,菌株C27感官评分最高,为88分,同时其发酵第8天的辣椒酱中总酸含量也最高,达到2.15g/100g,说明菌株C27比较适合发酵辣椒。由菌株C27发酵的辣椒酱颜色鲜红,发酵香味浓郁。因此,选择菌株C27进行后续的菌种鉴定。

表3 发酵辣椒酱发酵第8天总酸含量及感官评分测定结果Table3 Determination results of total acid contents and sensory evaluation of fermented chilisauce on the 8th day of fermentation

2.4 菌株鉴定

2.4.1 形态特征

菌株C27的菌落及细胞形态见图3。由图3A可知,菌株C27在MRS琼脂培养基上培养48 h形成的菌落边缘整齐、表面光滑、规则圆形、中心凸起、乳白色且质地均匀有粘性。由图3B可知,C27菌株革兰氏染色镜检照片显不C27菌株细胞呈球形,成对或链形排列,不形成芽孢。

图3 菌株C27菌落(A)和细胞形态(B)Fig.3 Colony(A)and cell(B)morphology of strain C27

2.4 .2生理生化特征

菌株C27生理生化试验结果见表4。

表4 菌株C27的生理生化特性Table4 Physiological and biochemical characteristics of strain C27

由表4可知,菌株C27在pH 4.8、10%乙醇中的生长情况、过氧化氢酶及精氨酸水解试验结果为阴性,其余试验项目结果均为阳性,根据参考文献[15-16]及《乳酸菌分类鉴定及实验方法》[17],菌株C27可能为肠膜明串珠菌属中的肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leu.mesenteroides subsp.mesenteroides)。

2.4.3 16SrRNA序列分析

将菌株C27 16SrRNA序列放入NCBI网站在线核酸数据库中进行比对,发现菌株C27和多株肠膜明串珠菌的相似性都在99%。肠膜明串珠菌属于明串珠菌属,目前EzBioCloud网站上共有13个种8个亚种明串珠菌模式菌的16SrRNA,分别是:柠檬色明串珠菌(Leu.citreum)、肉明串珠菌(Leu.carnosum)、乳明串珠菌(Leu.lactis)、假肠膜明串珠菌(Leu.pseudomesenterodies)、欺诈明串珠菌(Leu.fallax)、Leu.holzapfelii、Leu.inhae、Leu.kimchii、Leu.miyukkimchii、Leu.palmae、Leu.rapi、JDVA s、EU469745 s、冷明串珠菌3个亚种:Leu.gelidum subsp.aenigmaticum、Leu.gelidum subsp.gasicomitatum、Leu.gelidum subsp.gelidum和肠膜明串珠菌5个亚种:乳脂亚种(Leu.mesenteroides subsp.cremoris)、葡聚糖亚种(Leu.mesenteroides subsp.dextranicum)、肠膜亚种(Leu.mesenteroides subsp.mesenteroides)、Leu.mesenteroides subsp.jonggajibkimchii、Leu.mesenteroides subsp.suionicum。因此将这些模式菌和菌株C27进行发育树构建,结果见图4。由图4可知,菌株C27与肠膜明串珠菌(Leu.mesenteroides)在一个聚类上。目前16SrRNA对于近缘菌种的区分鉴定存在局限性,对于肠膜明串珠菌种的亚种鉴定方法仍在探索中[21-22],因此本试验结合菌株形态学观察、生理生化特性及16SrRNA基因序列将菌株C27鉴定为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。

图4 基于16S rRNA构建C27菌株和明串珠菌属菌株的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain C27 and Leuconostoc strains based 16S rRNA sequences

2.5 菌株耐酸耐胆盐特性研究

辣椒酱中的乳酸菌要想在人体内定植并发挥作用,必需能够耐受人体胃肠道的极端环境。通常进食后人体胃液pH 3～4左右[23],小肠胆盐含量在0.03%～0.30%[24],因此本试验将菌株C27分别接种于pH 3.0的MRS肉汤及0.30%胆盐的MRS肉汤研究其耐酸及耐胆盐特性,结果见表5。由表5可知,在低酸及高胆盐的极端环境中菌株C27活菌数均有下降,但下降幅度不大,分别下降14.84%、9.24%。菌株C27在pH 3.0MRS肉汤中培养6h后存活率为85.16%,而0.3%胆盐的MRS肉汤中存活率达90.76%。若菌株存活率达到80%,则保证有足够的菌株通过胃到达小肠以发挥作用[25]。因此,菌株C27有较好的酸及胆盐耐受性,有望在人体肠胃中定植发挥作用。

表5 菌株C27酸及胆盐耐受性结果Table5 Results of acid and bile salt tolerance of strain C27

3 结论

本研究以新疆传统发酵制品酸马乳为筛选源进行乳酸菌的筛选,共分离出28株革兰氏阳性,过氧化氢酶阴性的菌株。菌株经测定亚硝酸盐降解率、24 h发酵液pH,初步筛选出8株乳酸菌。为进一步筛选辣椒酱专用菌,将菌株分别接种于辣椒酱,根据总酸含量和感官评价进行菌株复筛。最终筛选出一株菌株C27,其亚硝酸盐降解率达到88.91%,较目前研究来看亚硝酸盐降解率处于较高水平[26]。菌株C27发酵的辣椒酱风味好,且发酵至第8天时总酸含量达2.15 g/100g,高于目前的1.6g/100 g[8,20]。生理生化特性显不菌株C27为肠膜明串珠菌肠膜亚种。C27菌株经16SrRNA测序,根据比对结果,选择明串珠菌属的所有种及亚种进行发育树的构建,结果显不菌株C27与肠膜明串珠的亚种在同一分支上,鉴定菌株C27为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。乳酸菌为了发挥其益生性,适应人体肠胃道的极端环境是首要条件,菌株C27在pH 3.0及0.3%胆盐环境中能够生长。综上所述,菌株C27具有较高的应用价值,可为辣椒酱专用发酵剂提供优良菌种。