刘书中，钱 列，冯 帆，刘祖德，沈洪兴，王以朋，劳立峰*

(1.上海交通大学医学院附属仁济医院 骨科,上海200127；2.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 骨科,北京100730)

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族中的成员，具有广泛生物学作用。Urist等在1965年首次发现骨形态发生蛋白，至今已发现30多种BMPs，其中BMP-2、4含量占BMPs的92%且与肿瘤发生关系最为密切[1,2]。BMP-2作为超家族中的一员在调节细胞增殖、趋化、分化、凋亡和细胞外基质重建等生物学行为上发挥重要作用，多项研究显示BMPs信号通路可参与肿瘤的发生与进展[3-5]。磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路是细胞内重要的信号传递途径，参与调控细胞增殖、分化、迁移及凋亡等多种重要生物学行为[6]。磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路是参与调控细胞增殖、分化、迁移及凋亡等多种重要生物学行为的重要信号通路[6]。AKT是PI3K/AKT信号转导通路中的关键分子，其磷酸化功能能够使多种底物被活化，进而发挥相应的细胞生物学调控作用[6]。

美国FDA已批准将重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)用于脊柱融合手术及骨不连等骨科疾患的治疗，但近年来国内外多项研究表明rhBMP-2的临床应用可增加多种恶性肿瘤的患病风险[4,5,7,8]。本研究选用肝细胞癌SK-Hep-1细胞系作为实验对象，探讨体外条件下rhBMP-2对肝癌SK-Hep-1细胞增殖能力的作用及其可能机制，为rhBMP-2应用于骨科疾病临床治疗并预防肿瘤发生发展提供一定的基础实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

RhBMP-2，来自UCLA骨科实验室(加州，美国)；人肝细胞癌细胞系SK-Hep-1，来自上海市肿瘤研究所(上海，中国)；胎牛血清(FBS)、RPMI1640培养基及胰蛋白酶均购自Gibco，其他细胞培养相关试剂均为Gibco产品；RT-PCR相关试剂、DNA Marker、TRIzol、Western blot所用试剂等均购自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 肝细胞癌SK-Hep-1细胞于含庆大霉素100 U/ml、10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37℃、含5% CO2的细胞培养箱中常规培养，培养液每2-3天更换一次。所有实验均用对数生长期的细胞。

1.2.2MTT细胞增殖试验 取上述培养的肝癌SK-Hep-1细胞用2.5 mL/L胰蛋白酶消化，新鲜的培养液吹打下制成细胞悬液，用血球计数板计数，并调整细胞浓度到1×108cells/L，按照2×105cells/well SK-Hep-1细胞接种在96孔板中过夜，在无血清条件下，第2日加入不同浓度rhBMP-2处理，rhBMP-2浓度分别为0 μg/L(未加入rhBMP-2)、0.1 μg/L、1 μg/L、10 μg/L。分别培养24 h后，于倒置显微镜下观察。MTT试剂及二甲亚砜(100 μl/well)按照用法要求加入，将96孔板置于微量振荡器上摇震5 min，摇震过程避光进行。震荡结束后采用分光光度计进行检测，读取490 nm波长处吸光度值。

1.2.3流式细胞仪检测细胞周期 取前述培养液中的肝癌SK-Hep-1细胞，制成单细胞悬液，接种于新鲜细胞培养液中，调整细胞浓度为1×106/L，接种于超低黏附6孔板中，每孔1 ml。SK-Hep-1细胞于无血清条件下培养24 h后，各孔分别加入rhBMP-2 0 μg/L(未加入rhBMP-2)、0.1 μg/L、1 μg/L、10 μg/L，对照组加入等体积的溶剂二甲亚砜。 药物干预24 h后，用PBS液洗涤细胞并在37℃条件下加入5 μl AnnexinV-FITC及5 μl Propidium Iodide混匀，室温避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞周期、增殖及凋亡情况，具体操作方法按照说明书进行。

1.2.4Western blot检测 取肝癌SK-Hep-1细胞制成单细胞悬液，接种于新鲜细胞培养液中，调整细胞浓度为3×105/L接种于超低黏附6孔板中，每孔1 ml。于对数生长期分别收集细胞，进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿法转印，SK-Hep-1细胞于无血清条件下分别加入rhBMP-2 0 μg/L(未加入rhBMP-2)、0.1 μg/L、1 μg/L、10 μg/L，以p21、Cyclin E、PI3K/p85α、p-AKT(1∶250稀释)，AKT(1∶1 000稀释)及Actin(1∶1 000稀释)作为一抗，二抗为辣根过氧化物酶标记的抗体，孵育后使用ECL发光试剂盒暗室发光、显影、定影，进行荧光扫描并用软件Image-Pro Plus 6.0对蛋白质水平进行分析，按试剂盒说明书操作。

1.2.5RT-PCR检测 检测肝细胞癌SK-Hep-1细胞的增殖基因及mRNA表达水平，将SK-Hep-1细胞接种于6孔培养皿中，加入上述不同浓度(0 μg/L、0.1 μg/L、1 μg/L、10 μg/L)的rhBMP-2处理，并培养24小时。使用TRIzol试剂法分离提取出总RNA，以其为模板，通过逆转录酶合成cDNA，应用qRT-PCR技术定量合成mRNA。RT-PCR检测使用7300 RT-PCR仪完成，使用2-ΔΔCt法计算感兴趣区/GAPDH表达的mRNA。所有检测过程均在仪器使用说明书指导下完成。

1.2.6统计学分析 数据处理和统计分析采用SPSS 17.0完成，数据采用均数±标准差的表示方法。t检验比较组间差异，P<0.05为具有显著统计学差异。

2 结果

2.1不同浓度及作用时间rhBMP-2对肝癌SK-Hep-1细胞增殖的影响

2.1.1无血清条件下，不同浓度的rhBMP-2处理细胞48小时，通过MTT法检测rhBMP-2对细胞增殖能力的影响，研究发现较高浓度的rhBMP-2可抑制肝癌细胞系SK-Hep-1的增殖能力，1 μg/L，10 μg/L处理组与对照组相比，均存在统计学差异(P<0.05)(图1)。

2.1.2无血清条件下，10 μg/L的rhBMP-2处理细胞不同时间，通过MTT检测rhBMP-2对细胞增殖能力的影响，实验结果发现48小时后，rhBMP-2显著抑制SK-Hep-1细胞的增殖能力，差异具有统计学意义(P<0.05)(图2)。

2.2rhBMP-2对肝癌SK-Hep-1细胞周期的影响

2.2.1无血清条件下，10 μg/L的rhBMP-2处理细胞48小时，通过流式细胞仪检测细胞周期，结果显示rhBMP-2可影响细胞周期，增加处于G1期和S期SK-Hep-1细胞所占的比率(图3)。

2.2.2不同浓度的rhBMP-2处理细胞48小时，通过Real-time PCR检测不同浓度梯度的rhBMP-2对p21、cyclin E mRNA表达的影响，研究发现rhBMP-2可显著促进p21 mRNA的表达，显著抑制cyclin E mRNA的表达，并且其作用强弱具有一定的浓度依赖性(图4)。

图1不同浓度rhBMP-2对SK-Hep-1细胞增殖的影响图2不同作用时间rhBMP-2对SK-Hep-1细胞增殖的影响图3不同浓度rhBMP-2对SK-Hep-1细胞周期的影响图4不同浓度rhBMP-2对SK-Hep-1细胞周期蛋白p21,cyclinEmRNA表达的影响

2.2.3不同浓度的rhBMP-2处理细胞24小时，通过Western blot检测不同浓度的rhBMP-2对p21、cyclin E蛋白表达水平的影响，发现rhBMP-2可显著促进p21的表达，显著抑制cyclin E的表达(图5)。

2.3不同浓度的rhBMP-2对肝癌SK-Hep-1细胞系PI3K/Akt磷酸化水平的影响

不同浓度的rhBMP-2处理SK-Hep-1细胞48小时，通过Western blot检测rhBMP-2对p21、cyclin E蛋白水平的影响，结果显示rhBMP-2可显著促进p21的表达，显著抑制cyclin E的表达；通过Western blot检测不同浓度的rhBMP-2对PI3K/AKT磷酸化水平的影响，发现rhBMP-2可显著抑制PI3K/AKT的磷酸化，且具有一定的浓度依赖性(图5)。

3 讨论

重组人骨形态发生蛋白-2是一种具有高效促进骨生成作用的细胞因子，此外尚可发挥包括调节胚胎发生、骨骼形态发生、发育、血管生成和肿瘤发生等多种关键生物学作用[4,5,7,8]。自2002年美国FDA批准将rhBMP-2用于临床治疗后，其显著促进骨质形成的作用得到国际上的广泛认可[9]。迄今，rhBMP-2凭借其强大的诱导骨生成的特性已广泛用于骨折后骨不连和脊柱融合手术当中。然而，多项体外和在体试验证明肿瘤细胞BMP-2受体的存在，并且发现rhBMP-2具有促进某些肿瘤细胞生长、增殖、侵袭和转移的潜能[4,5,7,8]。近年来，国内外多项研究提出rhBMP-2的临床应用可能增加多种恶性肿瘤的患病风险，并可引起诸如逆行射精、脊髓神经根炎、异位骨化、局部组织肿胀等严重不良反应[10-13]。以上因素使BMP-2在脊柱融合手术及骨不连愈合治疗中的应用面临极大地限制和挑战。正因如此，国际上需要更多的基础与临床研究来充分评估rhBMP-2的临床应用风险。Skovrlj等[14]回顾性分析了rhBMP-2与肿瘤关联性的相关文献，提出rhBMP-2的临床应用并未显著增加患者恶性肿瘤的患病风险，但需要更多深入的体内与体外研究予以进一步证实。

图5 不同浓度rhBMP-2对SK-Hep-1细胞周期蛋白p21,cyclin E表达及其对PI3K/Akt磷酸化水平的影响

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在全世界最常见的癌症中位列第五位，既往研究表明BMP-4，BMP-7和BMP-9的异常表达与HCC的肿瘤发生及进展相关，但针对BMP-2对HCC细胞的生物学影响尚缺乏相关的研究报道[15-18]。外科医生希望将rhBMP-2的临床使用拓宽至肿瘤切除手术所致的骨缺损、骨转移癌及脊柱不稳定等治疗领域。实现上述应用的前提条件是在手术中使用rhBMP-2不会增加恶性肿瘤的患病风险。尽管多项研究已表明rhBMP-2在多种人类癌细胞系中表达并证实具有促进或抑制肿瘤细胞生长、增殖、分化、侵袭、转移及凋亡的作用，rhBMP-2在肝细胞癌及转移性肝细胞癌的发生、发展中的作用尚未被完全阐明。因此，需要进行临床前研究来评估rhBMP-2对使用者的肿瘤发生及生长的影响及其可能机制。Zheng等[19]率先研究了外源性BMP-2对肝细胞癌细胞系SK-Hep-1、Hep G2和Hep 3B细胞生长的影响，结果表明BMP-2可能通过调控PI3K/AKT信号传导通路对肝癌细胞的生长和迁移产生影响。Lao等[4]以肝细胞癌Hep G2细胞系为研究对象，发现rhBMP-2可以在体内条件下促进肝细胞癌的生长及骨转移过程，进一步证明分泌性磷蛋白24 kD(spp24)可以阻断rhBMP-2对Hep G2细胞生长及骨转移的作用，研究证明spp24有望成为肝细胞癌及肝细胞癌骨转移的有效治疗剂。本研究发现体外条件下rhBMP-2可显著抑制肝细胞癌SK-Hep-1细胞的增殖能力。无血清条件下不同浓度的rhBMP-2处理细胞24小时，发现rhBMP-2可增加G1期细胞所占比率。rhBMP-2可显著促进p21的表达，显著抑制cyclin E的表达，并显著抑制PI3K/Akt信号通路的磷酸化过程。研究证实在体外条件下rhBMP-2通过抑制PI3K/Akt信号通路的磷酸化过程对肝细胞癌SK-Hep-1细胞增殖能力发挥显著抑制作用，

本项研究尚存在诸多不足之处：(1)研究中没有设置spp24、noggin等对rhBMP-2及SK-Hep-1细胞系的影响，其相关性及作用机制尚需进一步探索。(2)本研究只是针对rhBMP-2对肝细胞癌SK-Hep-1细胞增殖能力的影响，而对细胞其它生物学行为的作用需进一步深入探讨。

综上所述，本研究通过上述实验证实在体外条件下rhBMP-2对肝细胞癌SK-Hep-1细胞增殖能力具有显著的抑制作用，并与PI3K/Akt信号通路密切相关。从基础水平进一步论证了rhBMP-2的临床应用不能显著增加肝细胞癌的患病风险，为在脊柱融合手术及骨不连等骨科疾病的治疗中应用rhBMP-2提供了一定的理论基础。